Объемные фигурки из бисера для начинающих: Категория: Животные и птицы из бисера

Фигурки и игрушки из бисера

5.2k.

Бисероплетение привлекает многих, тем более сейчас

1.9k.

Сделать сувенир своими руками — особое удовольствие.

884

Петух из бисера – это непросто уникальный и оригинальный

3.4k.

Вниманию рукодельниц, любящих необычные и красивые

1.4k.

Тигры – удивительные животные! Грация, красота, изящные

803

Многие умеют делать с бисера браслетики или бусы, а

748

Для любителей плетения из бисера или бусинок представлен

490

Перед вами мастер класс, благодаря которому даже новичок

1.4k.

Вниманию рукодельниц предлагается подобный мастер-класс

767

Слон — символ мудрости и достоинства. Вы можете создать

1k.

Сделать своими руками сказочную или обычную лошадь

537

Бисер ‒ очень интересный и несложный материал.

790

Все, кто увлекаются бисероплетением, не понаслышке

2k.

Крохотные и забавные поделки из бисера в виде симпатичных

783

Замечательным сувениром и подарком к Пасхе могут стать

2.5k.

На Пасху давно принято разукрашивать вареные яйца.

541

Совсем скоро придет самый любимый праздник взрослых

725

Плетеные из бусинок зайчики – это милые фигурки, которые

1.1k.

Птица из бисера может стать отличным украшением интерьера

915

Новогодние поделки из бисера выглядят нарядно и становятся

4.5k.

Кошечки и котята из бисера – одни из наиболее милых

339

Дарить игрушки, сплетенные из бисера, вовсе не обязательно

1.3k.

Плести объемные фигурки животных из бисера – увлекательное

705

Как здорово иметь дома свою персональную золотую рыбку!

739

Загадочные существа со скелетом не внутри, а снаружи.

916

Если вы хотите сделать небольшой оригинальный подарок

3.1k.

Никогда еще игрушка не выглядела так натурально.

1.3k.

Несмотря на то, что мозгов у этой рептилии не больше

Из бисера можно сделать фигурку любого вида: усатого кота, забавную божью коровку, новогоднюю красавицу. Работа потребует минимум времени, если будут использоваться полезные советы по созданию мини-шедевров из небольших бусин. Предлагаем вам краткие уроки, которые помогут сотворить своими руками плоские и объемные поделки с помощью бисера, лески и проволоки.

Начинающие мастерицы смогут попробовать себя в деле бисероплетения, попытавшись воспроизвести простые линейные фенечки, браслеты-косички и «дорожки». Если вы уже знакомы с основными узорами, правилами и приемами, то можете попробовать сплести необычные игрушки в виде насекомых, животных и сказочных персонажей.

Бисер может стать удачным материалом для создания уникальных дизайнерских украшений, игрушек на елку, интерьерных композиций. Размер плетенных фигур ограничивается только количеством бисера и вашим желанием.

Что делать с созданными творениями? Дарите их друзьям, поднимайте настроение близким, украшайте себя и не забывайте, что каждый шедевр может превратить вас в известного мастера, который сможет творить на заказ.

Животные из бисера. Схемы для начинающих и для детей

Ищешь уникальный подарок для друга, хочешь изготовить необычный брелок или просто собираешься украсить комнату маленьким сувениром? Тебе сюда! Животные из бисера оригинально дополнят любую деталь гардероба и прекрасно впишутся даже в самый неординарный интерьер.

41 127 т.

Животные из бисера… Это они так красиво сияют на солнце, играя всеми цветами радуги. Кто не хотел бы иметь в кармане такое блестящее чудо? Изготовь объемную фигурку из бисера, и цветной лучик света всегда будет с Тобой.

Для плетения животных из бисера Тебе понадобятся: разноцветный бисер, тонкая проволока и… хорошее настроение.

А чтобы сделать плетение из бисера легким и непринужденным, включи любимую музыку и внимательно посмотри схемы животных. Они помогут Тебе правильно организовать работу. Я подготовил для Тебя целый зоопарк представителей фауны нашей планеты.

Симпатичный слоник — символ мудрости, силы и доброты. Подари его лучшему другу, и животное непременно принесет ему удачу.

Красавица-черепаха станет прекрасным украшением Твоей мобилки.

Объемный мишка из бисера — прекрасная альтернатива знаменитому Тедди.

Добро пожаловать в подводное царство! Галантный осьминог эффектно украсит коллекцию ракушек, привезенную Тобой из моря.

Опасный скорпион. Такой аксессуар обязательно понравится мальчикам.

А как Тебе вот такая забавная обезьянка?

Мечтаешь о собственном попугае? Яркая птичка из бисера сделает Твою мечту на шаг ближе. А еще от красочного попугая непременно будут в восторге поклонники мультика «Рио».

Гордый павлин из бисера может стать настоящей изюминкой интерьера.

Как Тебе идея сделать крутой брелок на рюкзак в виде лисички?

Розовый фламинго — прикольный сувенир на День рождения, тем более, если именинник мечтает побывать на озере Накуру в Кении.

Маленький секрет: если хочешь сделать животное больше, но боишься изменений в схеме, просто выбери бисер большего размера, при этом основание должно быть прочнее и толще, чем конечности. Тогда пропорции фигурки сохранятся, и схему менять не потребуется.

Плетение из бисера животных — занятие интересное и кропотливое, требует внимательности и настойчивости, зато результат Тебя непременно порадует. Так что если креативность, терпение и изобретательность — Твое второе «Я», скорее к работе: создавать животных из бисера.

Читай также:

Заметили орфографическую ошибку? Выделите её мышкой и нажмите Ctrl+Enter

Объёмные фигурки котов

Объёмные фигурки из бисера – это увлекательное занятие. При первом знакомстве со схемами объёмных фигурок кажется, что сделать фигурки – тяжёлая задача, но спешим заверить – это не так. Один совет – для придания жесткости элементам конструкции рекомендуем использовать тонкую проволоку.

В последнее время искусство по бисероплетению, стало особо популярным среди рукодельниц и мастериц. Это модное рукоделие дарит многим возможность сделать самостоятельно красивые и необычные поделки. Изделия из бисера не только красивы, они еще и разнообразны. Фигурки котиков из бисера особо популярны, ведь они воплощение ласки, мира, уюта и доброты.

Существует 2 вида бисероплетения: плоское и объёмное. Объёмное бисероплетение сложнее плоского, но при этом изделие получается интереснее. Такой вид рукоделия позволяет развивать мелкую моторику и творческое мышление.

Кот для начинающих

Для плетения объемного животного из бисера (в данном случае кота) нам необходима проволока (желательно светлая, так как темная будет выделяться на белом бисере и портить вид), бисер черного и белого цвета, а так же несколько бисеринок красного (для ротика), зеленого (для глаз), серого (для хвоста)  цветов, а так же более крупную бисеринку розового цвета для носика.

Методом параллельного плетения выполняем работу по схеме, предложенной выше. Начинаем плетение с носа, заканчиваем хвостом.
При желании вы можете выполнить объёмное животное из бисера более крупное, например кот толстунчик, если увеличить схему пропорционально размерам данной.

Рыжий кот

Мы будем пополнять коллекцию котят таким милым, забавным котёнком из бисера. Мастер-класс поможет освоить технику объемного плетения бисером. Намного упрощает работу по бисероплетению котика схема, которая наглядно продемонстрирует в схематическом виде весь процесс работы. Именно этот мастер-класс отлично подойдет и для тех, кто только начинает осваивать этот вид работы, и уже для тех, кто имеет опыт.

Для работы нам понадобится:

1. проволока диаметром 0,3 мм
2. коричневый, белый, оранжевый, розовый и зеленый бисер 2,5 мм
3. леска

Приступаем к работе, вначале необходимо отрезать кусок проволоки, длина ее должна быть два метра. Поначалу нужно сплести одну большую деталь, которая будет головой, затем туловище, после хвост для котенка. После этого можно приступать плести ушки, лапки, которые делаются по отдельности.

Плетём по схеме

Начинаем с головы котенка, не забываем, что во время плетения вставить для ротика две бисеринки розового цвета, а для глазиков понадобится вставить еще две бисеринки зеленого цвета. Берем для ушек два маленьких отрезка проволоки и делаем треугольнички. Для того, чтобы ушки закрепить на голове, нужно протянуть концы проволоки через бисерины головных рядов.

Делаем теперь лапки котику, для этого берем четыре кусочка проволоки большого размера и делаем их по схеме, также согласно показанной схеме, крепим лапки к туловищу. Переходим после этого к оформлению мордочки котенка, а именно делаем глазки. Берем черную краску и рисуем зрачки на каждой зеленого цвета бисеринке. Просовываем через мордочку сквозь бисерины небольшие куски лески, это будут такие усики. Такого котика можно использовать не только как декор, но и сделать из него брелок или подвеску к рюкзаку или сумке.

Кото-шарик

Для работы приготовьте:

1. бисер
2. леска (приблизительно 4 м)
3. проволока
4. бусинка (диаметр 15-20 мм, ее мы и будем оплетать)

Плетем сеточку в три бисеринки, ширина 2,5 ромба.

Макушку бусины доплетаем мозаикой. Можно плести по очереди с каждой стороны, чтобы сетка не сползала.
Здесь длина сетки 14 ромбиков, 4 ряда плетения без убавок, в 5 ряду убрано 6 бисеринок и в 8 убрано еще 4 штуки.

Морда

Объемное бисероплетение – совсем не сложно, если внимательно изучить схему. Продолжаем. На фото звездочками помечены места, где прикрепляются щёчки и носик.  Здесь надо прошить два-три раза, но не туго, выходим из розовой бисеринки и подтягиваем двумя стежками к самой основе.

Подбираем глазки.

На этом этапе мордочку оставляем. Переходим к котику с конца.

Подводим иглу к месту, где крепится хвост.

Когда ушки будут готовы, кончик лески закрепляем и отрезаем. Если же лапы будут из лески – оставляем так.

Лапы

Находим ось симметрии. Выбираем бисеринки, к которым будем крепить лапки.

Для закрепления проводим проволоку через 2-3 бисеринки. Выходим из бисерины от лапок.

Лапки из лески делаем в два прохождения – на втором пропускаем самую ближнюю к белым бисеринам бусину. Это нужно чтобы котик стоял на полной лапке.

Лапки готовы.

Усы

Наматываем 10-15 см лески. Связываем моточек посередине узлом.

Маленьким крючком протягиваем петельки мотка между носиком и щечкой снизу вверх с каждой стороны. Один кончик надо пропустить через бисеринку основы или носика и связать со вторым кончиком, потом заправить в сторону моточка. Подстричь усы.

тот урок объемного бисероплетения закончен. Наш котик готов!

Обьемная шкатулка-сердце из бисера. Плетение из бисера. Бисероплетение. Beading

Кот и пантера

Сегодня мы предлагаем вам схему плетения брелков – объемных фигурок из бисера, котика и пантеры. Схема прилагается.
В данном случае мы видим, как выглядит пантера.

Ниже описано как сделать шарики на основе кольца и 4-х бисерин, ведь именно этот метод используется в технике плетения наших фигурок.
Выполняется шарик одним кончиком проволоки или лески, без основы. Схема собирания шарика показана на рисунку 111. В плетении используем бисер с крупными отверстиями.
Набираем на леску 4 бисеринки и замыкаем их в колечко, скрещиваем оба конца (рабочий и не рабочий) в бисерине. Как это сделать показано на рисунке 112 а. Узел в конце не завязывать. Оставляем хвостик длиной 6-7 см.
Снова набираем 3 бисерины и замыкаем в колечко, проводим конце лески в бисеринки 7 и 2 колечка-основания. Смотрите рисунок 112 б. Набрать 2 бисерины и замкнуть их в следующее колечко, пропускаем кончик лески в бисеринку 5 предыдущего колечка, сверху вниз и в бисеринки 2 и 3 колечка основания (смотрите рисунок 112 в).

Таким же образом выполняем еще одно колечко, леску проводим в бисеринки 8, 3 и 4, а далее – в бисеринку 7 первого колечка снизу вверх (рисунок 112 г).

Набираем на леску 1 бисеринку и пропускаем ее кончик в бисеринки 10, 4, 7 (смотрите рисунок 112 д).  Теперь шарик надо стянуть, он обретет объемную форму. Чтобы это сделать, проводим конец лески через бисеринки 6, 9, 11, 12. Леску туго натянуть. Чтобы закончить работу, протягиваем леску в бисеринку 7 сверху вниз (смотрите рисунок 112 е).

Далее завязываем узел из лески рабочего и не рабочего концов, концы лески подрезаем и оплавляем. Получился шарик из трех вертикальных рядочков бисерин, в каждом ряду – по 4 бисеринки. Всего – 12 (смотрите рисунок 113).

Вот что у нас получилось:

Чёрный кот

Подбираем ткань для игрушки. Складываем ее вдвое и вырезаем. Ниже на схеме указано какие детали и как нужно вырезать.

Схема

Детали головы сшиваем, набиваем головку ватой, зашиваем отверстие. У основания каждого ушка сделать маленькую складку и пришить уши. Пришиваем носик, глазки, вышиваем рот, делаем усы из ниток.

Теперь подготавливаем каркас, как показано на схеме ниже. Для этого необходимо взять 3 куска проволоки нужной длины, скрутить их вместе в центре. Делаем это так, чтобы одна из наших проволочек стала шейкой, переходящей в хвостик, две другие – лапками.

Обмотаем туловище котика ватой и нитками. Прикладываем к спинке кота обшивку для туловища, до этого сделав на ней небольшие надрезы для шейки и хвостика. Зашиваем внизу живота. Спереди и сзади обшивку подгибаем внутрь и зашиваем так, чтобы не было видно края.

Нанизываем на шею, лапки и хвостик бисер. Придаем нужную форму нашему каркасу. Лапки собираются на ниточку, используем шов «через край». На затылке котика делаем отверстие, вставляем в него петлю шейки из проволоки. Зашиваем отверстие.

Наша объемная игрушка из бисера готова!

Кот Толстунчик

В данной модели игрушки схемы нет, но сам принцип плетения будет представлен ниже с подробным описанием.

Нам нужен бисер для тела котика — серого или черного цвета, белый для мордочки, лапок и брюшка и красный для носика, вата для набивки, проволока для основы, мононить и “Пластика” для основы.

Изобретательность приветствуется всегда. Поэтому эта фигурка сделана автором из… жевательной резинки.

Плетение начинается с мордочки.

Используется прямое плетение или мозаикой. Можно бисером другого цвета сплести пятна или полоски на шкурке кота.  Можно внести изменения с помощью более крупного бисера, все зависит от вашей фантазии.

Лапки и хвостик выполняется техникой мозаичного жгута, их мы пришиваем отдельно.

Посмотрите на котика с разных ракурсов, так станет боле понятна техника плетения.

Золотистый кот

Подготавливаем набор необходимых принадлежностей:

1. бисер основного цвета (золотистый)
2. для окраса пузика и лапок бисер серебристого цвета
3. для глаз бисер зеленого цвета
4. для носика и ротика розовый и красный бисер
5. для создания тела один шарик большого размера
6. для головы шарик несколько меньше, нежели для тела
7. для хвоста и лапок проволока
8. леска для ушек
9. инструменты для бисероплетения
10. бисер в тон нитки

Вначале мы будем делать туловище котику. Для этого нужно покрасить большой шарик в тон основного цвета, которым будет котик. Оставляем при этом только не закрашенным белое пузико. Можно для работы подобрать шарик в нужный цвет.

После просыхания краски продолжаем работу. По всей окружности шарика начинаем плетение цепочки на нить бисером. Для удобства закрепляем шарик подручными средствами, после этого продолжаем плетение, увеличивая постоянно, незабываем, что нам нужно вставлять серебристый бисер делая, таким образом животик котику.

Когда ряд вдоль окружности шара получится широкий, начинаем убавлять по бисерине.

Теперь начинаем делать хвостик и лапки. Для этого берем небольшой отрезок проволоки и складываем ее пополам.

На серединку проволоки надеваем бусину в цвет основного окраса кота. Нанизываем бисер до половины проволоки, затем надеваем несколько бисерин серебристого цвета и затем снова золотистого. Должно в итоге получиться одинаковое количество бисерин, теперь сгибаем проволоку пополам и закручиваем ее. Так делаем все остальные лапки.

Самый длинный кусок проволоки будет для хвостика, плетем его точно также как и лапы. При помощи кончиков проволоки лапок и хвоста закрепляем их к телу котика. Пропускаем проволоку сквозь бисерину в предполагаемом месте, и оставшиеся проволоки скручиваем вокруг проволоки. Отрезаем оставшиеся или накручиваем на лапу, придерживаемся при этом симметрии.

Теперь делаем голову кота, для этого берем шарик, который мы заранее приготовили. Если не оказалось такого, то можно просто взять кусок фольги и свернуть ее, сделав шарик диаметром немного меньше, нежели туловища кота. Шарик окрашиваем под основной цвет кота акриловой краской.

Закрепляем его, пропустив сквозь шар иглу с леской, и начинаем оплетать голову бисером. Начинаем с пояска плетем как и тело. Как завершающий этап создаем котику симпатичную мордочку.

Берём две бусины зеленого цвета и симметрично пришиваем их одну возле другой. Нос и ротик проплетаем сквозь бисерин мордочки розовыми бусинами.

Для ушек создаем угол из проволоки и нанизываем на нее бисерины, делать их можно любой формы по желанию. Для усов используем лески, которые пропускаем сквозь мордочку на месте носика.

Осталось закрепить голову к туловищу, а потому на одном из двух шариков проплетаем один ряд крестиками из бисера, так мы формируем шею. Затем пришиваем голову к туловищу и плотно затягиваем все нити. Для декора можно сделать бантик и прикрепить котику из любой тесьмы. Теперь котик готов.

Влюблённый кот

Для выполнения вот такой объемной игрушки из бисера в виде красивого котика нам нужно: бисер двух цветов – на окрас и на животик и лапки. Красный бисер на сердце. Совсем чуть-чуть бисера для рта, глаз и носика, а также шарик (для пинг-понга). Леска, проволока. Бусины на лапки и хвост (потолще) и уши (потоньше).

Шарик красим под цвет кота и оставляем кружочек под животик.

По крашеному шарику плетем крестиком цепочку по его окружности. Шарик стоит проколоть накрест, чтобы оплетка не скользила по нему.

Наплетаем полоску по обе стороны от белого пятнышка таким образом, как показано на фото. Когда ряд становится слишком широким – убавляем (плетем две бусины как одну).

Получаем оплетеный шарик. Это тело котика.

Далее займемся хвотиком и лапами. На проволоку, сложенную пополам, надеваем бусину и закручиваем, оставляя кусочки на 2-3 см. Делаем 5 заготовок. Самая длинная – для хвоста. Самые короткие для передних лап.

Прикрепляем хвост и лапы к телу котика таким способом: продеть через бисерину, закрутить и убрать кончик (обкусить). Можно не обкусывать, а просто обмотать.

Теперь лапы и хвост надо оплести. Делаем это способом мозаичного жгута. В данном случае – на 5 бисеринах с 3 бисеринами в основе.

Сердце делается так: плетется полотно крестиком по форме сердечка, делаем таких 2 штуки. Расчет – 5х3 крестика. Далее сшиваем крестиком же, внутрь вставляем бусины и все это надо пришить к лапкам котика.

Делаем мордочку: глазки-бусинки пришиваем. Носик и мордочку надо проплетать между бисерин нашей оплетки. Делаем уши и усы.

Крестиком приплетаем голову к телу.

Закрепляем леской с помощь иглы.

Объёмная игрушка из бисера готова. Симпатичный котик, которого не стыдно подарить.

Белый кот

Для объёмных фигур, таких, как белый кот из бисера, используется леска или проволока, на леске изделие получается лучше. При объёмном бисероплетении указанное на схеме количество бисерин набирается в замкнутое кольцо, а затем добавляются новые ряды.

Двумя иглами набираем цепочку из 14 пар бисерин (рисунок 1),замыкаем цепочку в кольцо, соединив начало и конец. Обе иглы выводим в одну сторону, через пары кольца, находящиеся напротив стыка. Плетём ещё одну цепочку из 6 пар бисерин. Получился каркас головы кота. Полностью голову мы делаем по схеме номер 2.

Уши кота плетём по схеме на рисунке 3, приплетая их к основе головы в месте, указанном на рисунке 4. На этой основе головы с ушами нужно сделать дополнительные подплетения, имитирующие шерсть (рис.5). Пометим 3 бисеринками га мордочке нос, сделаем глазки и прикрепим нос. Усы плетём из мелкого жемчужного бисера – 8, 8 и 6 бисеринок в каждом усике кота (рис.6).

Приплетаемся к бусинам головы и делаем туловище (рис.7). После того, как сделали туловище, приплетам к нему лапы и хвост (рис.8,9,10).

Чтобы белый кот получился пушистым, нужно выполнить дополнительные подплетения (рис 8). За счёт подплетений можно получить разные фигурки котов. Можно сделать белого и чёрного кота, выбор за вами.

Объёмная фигурка Кошка Мурка

Котёнок с бантиком и с мышкой

Плетение начинается с носа, и затем плетём голову (рис.1).

Тут заканчиваем плести голову, начинаем уши (рис. 2).

Дальше плетём тело (рис. 3,4,5).

Плетём переднюю лапку (рис. 6).

Задняя лапка (рис. 7, 8).

Далее, делаем хвост (рис. 9,10).

Бантик на шею, можно сделать из любых бусинок.

Мышка из бисера.

Мышка в смокинге

Смотрим на рисунки, всё можно понять по рисункам. Начинаем с головы.

Туловище фигурки.

Ноги нашей мышки.

Ручки мышки, смотрим на главное фото.

Волюметрическая кальциевая визуализация 1 миллиона нейронов в областях коры при клеточном разрешении с помощью микроскопии световых шариков

Генерация световых шариков с помощью MAxiMuM

Целью LBM является облегчение мезоскопической волюметрической визуализации Ca ²⁺ , совместимой с оптимальными пространственно-временными условиями взятия проб выше. Для достижения этой цели мы создали автономный модуль под названием MAxiMuM, способный генерировать необходимые столбцы мультиплексированных лучей. Лазерный свет фокусируется на входе в полость MAxiMuM и повторно отображается серией вогнутых зеркал (рис.1б, подробные схемы на рис. S1 и S2). Существует преднамеренное смещение Δz между номинальным фокусом зеркал повторного формирования изображения и входом в резонатор, таким образом, когда луч возвращается на вход, происходит осевое смещение его фокуса. Прежде чем достичь входа в полость, луч встречает частично отражающее зеркало, которое отражает большую часть света обратно в полость для следующего обхода с небольшим боковым смещением относительно первого луча. Оставшаяся часть света выходит из полости и попадает в расположенный ниже по потоку микроскоп.Из-за фокального смещения каждый луч, выходящий из резонатора, фокусируется на меньшую глубину в образце с относительным уменьшением оптической мощности, так что мощность в луче i ^th равна P _i = T (1 — T ) ⁱ , где T — пропускание частично отражающего зеркала.

В области 2pM хорошо известно, что поддержание отношения сигнал / шум на глубине требует экспоненциального увеличения мощности лазера из-за потери баллистических фотонов из-за рассеяния на ткани.Отсюда следует, что пропускание полости, T , можно отрегулировать таким образом, чтобы относительное увеличение мощности для каждого последовательного луча соответствовало увеличению, необходимому для компенсации дополнительного рассеяния ткани из-за осевого разделения между соседними плоскостями, δz , и таким образом достигается постоянное отношение сигнал / шум для всех мультиплексированных лучей. Это условие определяется: где l _с — длина свободного пробега ткани мозга при рассеянии (∼200 мкм для длины волны лазера 960 нм ³⁸ ) и соотношение между осевым разделением лучей, выходящих из полости ( Δz ), по сравнению с в образце ( δz ) имеет вид Δz = M ² δz , где M — боковое увеличение микроскопа.Уравнение (1) обеспечивает правило проектирования для достижения заданной осевой плотности отбора проб с помощью подхода LBM (см. Дополнительное примечание 1). Эта гибкость конструкции представляет собой отличительную особенность LBM и ключевое отличие от реверберационной микроскопии, где пропускание обязательно фиксируется на уровне 50%, что приводит к δz ~ 100 мкм в ткани мозга и ограничивает возможную множественность ~ 8- сгиб на глубине проникновения 2 пМ.

Мы разработали наш модуль MAxiMuM на основе существующего мезоскопа (NA = 0.6, FOV = 6 мм, рис. S3) и охарактеризовал каждый световой шарик в пространстве образца (рис. S4, дополнительное примечание 2), чтобы гарантировать желаемые временные и пространственные характеристики. Посредством этих калибровок мы подтвердили ограниченное время жизни флуоресценции задержки между шариками (6,7 нс) и минимальные перекрестные помехи между каналами, в то время как осевое положение, в котором сфокусированы наши шарики, линейно увеличивалось с числом шариков для наших 30 световых шариков в общей сложности. осевой диапазон ~ 500 мкм. Мы также подтвердили, что поперечный и осевой диаметр локализации наших световых шариков составляет ∼1 мкм и ∼13 мкм соответственно; Достаточно для получения изображений с клеточным разрешением плотно меченых образцов.

Оптимизация эффективности пространственно-временной выборки

Чтобы максимизировать пространственно-временную эффективность выборки и запись с максимально возможным полем обзора, необходимо записывать только минимальную информацию, необходимую для точного извлечения интересующих характеристик — в нашем случае тела нейронных клеток. Соответственно, мы намеревались определить минимальные требования к пространственной выборке, чтобы разрешить переходные процессы GCaMP нейронов неокортекса мыши. Мы записали несколько одноплоскостных стеков данных с высоким разрешением и отправили их в конвейер анализа (рис.S5, подробности см. В дополнительном примечании 3), сравнивая извлеченные следы и временные ряды с ручными сегментами функциональных наземных истин для каждого набора данных. Используя оценку F (определяемую как среднее гармоническое значение истинных и ложноположительных результатов) в качестве показателя точности извлечения, мы оценили, как ухудшается производительность в зависимости от разреженности выборки, удаляя пиксели из стеков боковых изображений. В соответствии с нашими предыдущими результатами, ^{24, 25} , мы обнаружили, что F-оценка значительно снижается только для латеральной пространственной выборки> 5 мкм (рис.S6a). Таким образом, чтобы максимизировать объем изображения при сохранении высокой точности извлечения сигнала, мы нашли оптимальную выборку ∼5 мкм в боковой плоскости.

Дополнительным фактором при оптимизации микроскопа является размер и форма PSF. Как мы показали ранее, ^{24, 25} увеличенный, сфокусированный во времени PSF увеличивает чувствительность обнаружения нейронов в режиме разреженной выборки за счет повышенного спроса на энергию импульса на воксел для поддержания отношения сигнал / шум.Для этой первоначальной демонстрации LBM мы использовали оптимальную чувствительность, чтобы увеличить отношение сигнал / шум на луч с максимально возможной степенью множественности (и, следовательно, с максимально возможным полем обзора) в рамках ограничений бюджета мощности. Тем не менее, наше моделирование (рис. S6a) предполагает, что точность экстракции системы достаточна для обнаружения большинства активных клеток в пределах поля зрения.

Мультирегиональная и мультисенсорная визуализация активности> 200000 нейронов в коре головного мозга мышей

Мы проверили LBM, выполнив визуализацию in vivo неокортекса бодрствующих и ведущих мышей, трансгенно экспрессирующих GCaMP6 в глутаматергических нейронах. ^{5, 37} Используя нашу оптимизированную стратегию пространственной дискретизации в объеме ∼3 × 5 × 0,5 мм ³ , мы могли поддерживать частоту кадров ∼5 Гц, совместимую с разрешением переходных процессов GCaMP. Мы сориентировали поле зрения так, чтобы охватить как можно больше различных областей в пределах одного полушария коры, включая SSp и PTLp, а также RSP и VISp (рис. 2a) на глубинах, соответствующих слоям с I по IV (рис. 2b). Чтобы вызвать активность нейронов, распределенных по множеству функциональных областей в пределах поля зрения, мы разработали парадигму двойных сенсорных стимулов, включая усы и визуальную стимуляцию.Во время испытаний усов мы повредили большинство усов, контралатеральных по отношению к изображаемому полушарию. Каждая визуальная проба состояла из высококонтрастной дрейфующей решетки с ориентацией в соответствии с последовательностью горизонтального, 45 °, вертикального, 135 °, которая повторялась до на протяжении всей записи. Общая парадигма стимулов состояла из проба с усами, визуального испытания, за которым следовали одновременные испытания с усами и зрительный образ с 5-секундными интервалами между каждым испытанием. Кроме того, наша беговая дорожка была оборудована системой отслеживания скорости и видеозаписи животных с фиксированной головой, чтобы фиксировать движения задних или передних конечностей, связанные со спонтанным поведением, т.е.Движения, которые не были результатом тренировки или вызваны внешними стимулами (фильм S1). Типичные записи в этой модальности варьировались от 9 до продолжительностью 30 минут, давая популяции из 159 — 460 000 нейронов (12 записей от N = 6 мышей, см. Рис. S6a).

a , 3D-рендеринг извлеченных пространственных координат нейронов и максимальной прогнозируемой активности для 9-минутной записи.Поперечное изображение мозга воспроизведено из работы. 53. См. Также фильм S2. b, Y-Z проекция плотности нейронов; примерные границы между корковыми слоями обозначены зелеными линиями; все значения глубины отображаются относительно pia. c, Среднее проекционное изображение по записи на глубине 344 мкм. Масштабная линейка: 250 мкм. Вставка: увеличено в области c , масштабная линейка: 100 мкм. См. Также Movie S3. d, Тепловая карта всех 207 030 нейронов, извлеченных из записи в a , нормализованная до максимального значения ΔF / F ₀ . e , подмножество 3000 трасс от c показано в полном разрешении. f , подмножество из 50 следов от g с усами и визуальными стимулами, обозначенными красными и синими маркерами соответственно. Смещение: 0,5 ΔF / F ₀ .

На рисунке 2 показаны данные репрезентативной 9-минутной записи 207 030 нейронов, распределенных в осевом диапазоне ~ 500 мкм в пределах нескольких областей коры, упомянутых выше (объемная визуализация на фиг. 2a и Movie S2).Как и ожидалось (рис. S6), и в соответствии с пространственно-временными характеристиками световых шариков, генерируемых MAxiMuM (рис. S4), отдельные нейроны действительно могут быть точно разрешены (рис. 2c, Movie S3), что позволяет извлекать с высокой точностью их временные ряды (рис. 2d – 2f). Из-за огромного количества данных трудно одновременно отобразить временные ряды всех 207 030 нейронов с полным разрешением. На рис. 2d показана обзорная тепловая карта всех нейронов (см. Фильм S4), а на рис. 2е показана подробная тепловая карта подмножества из 3000 нейронов, демонстрирующих периодическую активность, вызванную стимулом.Следы для дополнительного подмножества из 50 нейронов показаны более подробно на рис. 2f, причем визуальные и усовидные пробы обозначены синими и красными метками соответственно. Временная шкала наблюдаемых переходных процессов кальция согласуется с характерным временем отклика GCaMP6s (рис. S7) и показывает корреляцию как с визуальными, так и с усовыми стимулами.

Для дальнейшего исследования настройки нейронов на внешние переменные, мы вычислили распределение корреляций между временными рядами каждого нейрона со скорректированными лагом, свернутыми по GCaMP-ответу-ядром временными векторами, связанными с предъявлением каждого из стимулов. , и.е . испытания усов, визуальные испытания, а также корреляция со спонтанным, неинструктированным поведением животных, включая движения передних или задних конечностей (рис. S8a – 8c). Мы обнаружили субпопуляции нейронов, охватывающих многие области коры (рис. 3a – 3e), которые были сильно настроены на каждый стимул ( R> 3 σ , где σ — стандартное отклонение соответствия нормального распределения распределению корреляций между временными рядами нейронов и перетасованным во времени вектором стимула, подробности см. в Методах), насчитывающих 34 468 нейронов с усами, 24 299 нейронов с визуальной настройкой и 64 810 нейронов, настроенных на неинструктированное поведение животных.

a , Области мозга, охваченные записью, показанной на рис. 2, воспроизведены из работы. 53; SSp = первичная соматосенсорная область, LL = домен нижней конечности, UL = домен верхней конечности, SSp-TR = домен туловища, BFD = бочкообразное поле, PTLp = задняя теменная ассоциативная область, VISp = первичная визуальная область, RSP = ретросплениальная область. Масштабная линейка: 250 мкм. b – e , Поперечное пространственное распределение нейронов, настроенных на одно условие стимула.Корреляционная матрица (см. Рис. S8d) для всех настроенных нейронов была иерархически сгруппирована и отсортирована по предпочтительным стимулам, генерирующим 4 кластера, представленных синим, зеленым, желтым и красным цветом соответственно на всех рисунках. Каждая карта соответствует стимулам усов, визуальным стимулам или поведению соответственно, причем e соответствуют популяции нейронов, не коррелированных ни с одним стимулом. Масштабные линейки: 250 мкм. f – i , Пример нейронных следов из популяций, настроенных на раздражители усов, зрительные стимулы, спонтанное поведение или некоррелированные, соответственно.Появление стимулов обозначается маркерами в соответствующих случаях. Смещение: 1.0 ΔF / F ₀ . j, k , усредненная по пробам активность примеров нейронов с усовыми настройками с (пурпурный в j , голубой в k ) и без (серый) присутствием одновременного визуального исследования. В – активность нейрона, настроенного на усы, положительно модулируется, т. Е. Увеличивается, когда визуальные стимулы предъявляются одновременно; в k другой нейрон с усами имеет отрицательную модуляцию.Сплошные линии обозначают среднее значение всех испытаний, заштрихованные области обозначают 1 стандартное отклонение от среднего. l , Боковое пространственное распределение пурпурной и голубой популяции в j и k . Масштабная линейка: 250 мкм. m , латеральное пространственное распределение визуально настроенных нейронов, положительно и отрицательно модулируемых одновременными раздражителями усов. n , латеральное пространственное распределение нейронов с усами, положительно и отрицательно модулируемых одновременным поведением животных. o , латеральное пространственное распределение визуально настроенных нейронов, положительно и отрицательно модулируемых одновременным поведением животных. p , единичная пробная активность, например нейроны, настроенные на раздражители усов для испытаний с одновременными визуальными раздражителями. Крайний левый переходный процесс показывает усредненную по опыту активность, а заштрихованная часть обозначает 1 стандартное отклонение от среднего. Необработанные данные для каждого примера переходного процесса в испытаниях 1–15 показаны маркерами, черные линии обозначают отклик после деконволюции; координаты каждого нейрона указаны в миллиметрах для каждого нейрона; горизонтальная и вертикальная шкалы: 1.0 ΔF / F ₀ , 5 с. q , единичная пробная активность, например нейроны, настроенные на неинструктированное поведение животного; крайний левый переходный процесс показывает усредненную по опыту активность с заштрихованной частью, обозначающей 1 стандартное отклонение от среднего; необработанные данные для каждого примера переходного процесса в испытаниях 1–5 показаны маркерами, черные линии обозначают отклик после деконволюции; координаты каждого нейрона указаны в миллиметрах для каждого нейрона; горизонтальная и вертикальная шкалы: 1.0 ΔF / F ₀ , 5 с. r , Тепловая карта усредненной по пробам активности нейронов с настраиваемым поведением с относительной задержкой, обозначенной наложенной черной линией. Тепловая карта нормализована до максимального значения ΔF / F ₀ для каждого нейрона, а пробное усреднение включает 5 лучших испытаний поведения на самой высокой скорости. s , Боковое пространственное распределение нейронов, настроенных на поведение, обозначенных цветом по относительной задержке. Масштабная линейка: 250 мкм. См. Также Movie S5. t , Кумулятивная доля популяций, настроенных на данное состояние (стимул усов, визуальный стимул, спонтанное поведение, некоррелированное) со значительной взаимной корреляцией ( R> 3σ ), захваченных в пределах данного разделения нейронов и нейронов.

Мы выполнили иерархическую кластеризацию на матрице взаимной корреляции популяции всех 123 577 нейронов, настроенных на стимул (рис. S8d), и обнаружили 4 отдельных кластера, определенных путем обеспечения одинаковых расстояний от узла до ствола для каждой результирующей ветви дендрограммы. Впоследствии мы сопоставили эти кластеры и нейроны внутри них с их анатомическим расположением в головном мозге. На рисунках 3b-3d показано латеральное пространственное распределение нейронов по всей коре, связанных с данным состоянием (стимуляция усов, визуальная стимуляция и неинструктированное спонтанное поведение соответственно), с цветовой кодировкой их соответствующих кластеров, а на фиг.3e показано латеральное распределение 13 259 нейронов, не коррелированное с каким-либо условием стимула ( | R | <σ ). Для большинства условий стимула можно наблюдать распределение соответствующим образом настроенных нейронов по множеству областей коры (рис. 3а). Для каждого условия, а также для некоррелированной популяции мы можем точно выделить переходные процессы отдельных ячеек, как примеры, показанные на рис. 3f – 3i соответственно демонстрируют.

Кластер 1 (синий) располагался преимущественно в поле ствола (SSp-BFD) и PTLp (рис.3а), и, соответственно, был широко представлен в популяции с усами (рис. 3б). Этот кластер также был широко представлен в популяции, коррелирующей со спонтанным поведением (рис. 3d), что предполагает смешанный ответ нейронов в этом кластере на оба стимула. Кластер 2 (зеленый) был представлен только в нейронах с настраиваемым поведением (рис. 3d) и в основном располагался в специализированных областях SSp, связанных с ощущениями в нижних конечностях, верхних конечностях и туловище животного (SSp-LL, SSp- UL и SSp-TR соответственно), а также PTLp (рис.3а). Кластер 3 (желтый) был расположен в VISp и PTLp и представлял нейроны, коррелированные со всеми условиями стимула. Присутствие визуально связанных нейронов в популяции, настроенной на усы, могло быть связано с тем, что животное могло видеть движение кисти, стимулирующее усы во время предъявления стимула. Последний кластер 4 (красный) был распределен по нескольким регионам, включая SSp, VISp, PTLp и плотную популяцию внутри RSP, которая, как считается, связана с кодированием пространственной памяти. ³⁹ Было обнаружено, что это подмножество, расположенное внутри RSP, в первую очередь настроено на неинструктированное спонтанное поведение (рис. 3d). Анализ пространственной кластеризации предполагает, что, хотя некоторые из этих функциональных кластеров перекрываются с различными анатомическими областями мозга, нейроны в этих областях также могут совместно представлять несколько условий стимула или могут иметь вызванную стимулом активность, которая дополнительно модулируется наличием дополнительных стимулов. .

Для дальнейшего изучения смешанного представления мы проанализировали усредненную по пробам активность нейронов, настроенных на стимул.Во-первых, мы рассмотрели разницу в усредненной в испытании активности нейронов с усами для испытаний, в которых присутствовал только стимул усов, по сравнению с испытаниями, в которых одновременно возникали и усы, и зрительные стимулы (рис. 3j-3l). Примеры усредненных по пробам переходных процессов как для положительно, так и для отрицательно модулированного нейрона показаны на рис. 3j и 3k соответственно. Латеральное пространственное расположение значительно ( p < 0,05, определено с помощью t-критерия) модулированных вверх и вниз нейронов показано на рис.3л. Было примерно одинаковое количество нейронов, настроенных в виде усов, положительно (3703 нейрона) и отрицательно модулированных (4166 нейронов). Однако было четкое различие между анатомическим расположением двух популяций: положительно-модулированные нейроны, расположенные в основном в SSp-BFD, и отрицательно-модулированные нейроны, расположенные в VISp. На рис. 3м показана карта визуально настроенных нейронов, активность которых существенно модулируется одновременным предъявлением стимулов усов. Визуально настроенные нейроны в основном отрицательно модулировались наличием раздражителей усов и располагались внутри VISp.Рисунки 3n и 3o показывают популяцию усов и визуально настроенных нейронов, значительно модулированных совпадающими неинструктированными спонтанными поведениями животного. В обоих случаях большинство нейронов с усами и визуальной настройкой позитивно модулируются спонтанным поведением.

Кроме того, на уровне отдельного исследования, популяции, настроенные на стимулы и поведение, демонстрируют значительные различия между нейронами и между испытаниями. На рисунке 3p показан пример следов восьми нейронов, настроенных на раздражители усов в присутствии совпадающих визуальных стимулов.Во всех случаях ответ данного нейрона значительно варьируется от испытания к испытанию. В некоторых случаях нейроны, анатомически разделенные более чем на 1 мм, демонстрируют вариации активности между испытаниями, которые коррелированы (нейроны 1–4), в то время как в других случаях вариации активности от испытания к испытанию не совпадают ни с вышеуказанной группой, ни друг с другом. (нейроны 5–8). На уровне популяции мы обнаружили, что корреляции между экспериментами между нейронами с усами (рис. S9a) и нейронами с визуальной настройкой (рис. S9b) имеют положительный перекос ( r = 0.16 ± 0,24 и r = 0,26 ± 0,29 соответственно) и согласуются с ранее измеренными значениями. ⁴⁰

На рисунке 3q показан пример единичных пробных ответов нейронов, настроенных на неинструктированное поведение. Ответы этих нейронов не просто колеблются в величине одиночных переходных процессов, но также демонстрируют вариабельность общего количества переходных процессов, а также времени начала их ответов в ходе испытаний. Мы количественно оценили эту изменчивость во времени начала, вычислив запаздывание времени начала активности каждого настроенного на поведение нейрона по отношению к началу поведения, и нашли a ~ 1.7-секундная задержка между временем пика активности самого раннего и самого позднего нейронов. Рис. 3r показывает тепловую карту настроенной на поведение популяции, отсортированной по предпочтительному лагу и пробному усреднению по 5 верхним движениям с наибольшей скоростью, тогда как на рис. 3s показаны латеральные положения этих настроенных на поведение нейронов, окрашенные в цвет по относительному времени начала (фильм S5 ). Самые ранние отвечающие нейроны в основном расположены в областях мозга SSp-TR, SSp-LL и SSp-UL, в то время как нейроны в областях, более удаленных от этих сенсорных областей, включая RSP, PTLp, SSp-BFD и VISp, отвечают. значительно позже, в соответствии с предыдущими результатами в литературе. ¹¹

Пространственная и временная структура нейронов, зафиксированных в этих записях, подчеркивает необходимость мезомасштабной и объемной записи. Настроенные на стимулы, настроенные на поведение и некоррелированные нейроны в записи, показанной на рис. 2 и 3 демонстрируют коррелированную активность, которая охватывает расстояния между нейронами на 2–4 мм (Fig. 3t), и, таким образом, требует записи в мезомасштабе для захвата динамики всей популяции. Кроме того, нейроны, настроенные на стимулы, демонстрируют изменчивость реакции от испытания к испытанию, которая, по-видимому, зависит от популяции, несмотря на разделение попарными расстояниями в мезоскопических масштабах (рис.S9c) и располагаясь в осевых слоях по всей глубине коры (Fig. S9d ) . Такие ковариации нейронных ответов, также называемые «шумовыми корреляциями», были предложены для представления распределенной, закодированной информации более высокого измерения, лежащей в основе взаимодействия внешних стимулов и поведенческих состояний с внутренними состояниями, или для представления информации, относящейся к неконтролируемым аспекты предъявления стимула или неотслеживаемые поведенческие состояния. ^{11, 41} Из-за внутренней природы корреляций шума, которые меняются в зависимости от испытания, любое пробное усреднение принципиально препятствует их обнаружению.Таким образом, хотя последовательные записи поля зрения в одной плоскости и мозаики потенциально могут захватывать одну и ту же популяцию клеток, показанную здесь, вариабельность их ответов, записанная с помощью нашего метода, от испытания к испытанию при таком подходе по своей сути теряется. Более того, поскольку считается, что эти шумовые корреляции кодируют информацию о состоянии мозга, неинструктированном поведении или непреднамеренных стимулах, отсюда следует, что устранение неоднозначности популяции нейронов с коррелированными вариациями (нейроны 1–4, рис. 3p) от тех, у которых нет корреляции между пробами и экспериментами. пробная активность (нейроны 5–8, рис.3p), а также надежность любой информации, переносимой проекциями динамики всей популяции, будет улучшаться по мере увеличения числа зарегистрированных нейронов аналогично традиционному кодированию стимулов в первичных сенсорных областях. ^{9, 41}

Реконфигурируемая многомасштабная визуализация с помощью LBM

LBM поддерживает возможность поиска компромиссов между дискретизацией боковых вокселей, полем обзора и скоростью визуализации для соответствия многочисленным приложениям. Уменьшая ход зеркал сканирования, можно увеличить плотность выборки за счет FOV, а добавляя больше областей бокового сканирования, можно увеличить FOV за счет увеличения объема.Например, рис. 4a – 4c показаны средние проекционные изображения и примеры нейронных следов из объема ∼600 × 600 × 500 мкм ³ в PTLp мыши, экспрессирующей jGCaMP7f ⁴² (см. Также фильм S6) при скорости звука ∼10 Гц и 1 Выборка латеральных вокселей в мкм, достаточная для определения субклеточных особенностей, таких как нейронные отростки активных клеток. Ослабление выборки вокселей до промежуточной латеральной выборки ∼3 мкм (рис. 4d – 4g, фильмы S7 и S7) позволяет увеличить объем записи до ∼2.0 × 2,0 × 0,5 мм ³ при частоте сбора данных 6,5 Гц, чтобы уловить активность популяции из ~ 70 000 нейронов у мышей с трансгенной меткой GCaMP6 при разрешении изображения выше, чем то, что необходимо для разрешения типичного кортикального слоя у мышей. нейроны.

a – c , Объемное изображение высокого разрешения (∼600 × 600 × 500 мкм ³ ) нейроактивности при 9,6 Гц у мышей, экспрессирующих jGCaMP7f.Типичные средние проекционные изображения нейронов в плоскостях a 440 мкм и b 384 мкм, соответственно, взятые из вышеуказанного объема во время 3-минутной записи. Масштабные линейки: 50 мкм. Вставка с увеличенными областями, масштабные линейки: 10 мкм. См. Также Movie S6. c , репрезентативный временной ряд 9 нейронов, очерченных в увеличенной области плоскости в b. Смещение: 1.0 ΔF / F ₀ . d – g , Запись 70 275 нейронов в объеме ∼2 × 2 × 0.5 мм ³ при 6,7 Гц и 2,8 мкм латеральной дискретизации вокселей. d , 3D-рендеринг извлеченных пространственных координат нейронов и максимальной прогнозируемой активности для 9-минутной записи. Поперечное изображение мозга воспроизведено из работы. 52. См. Также фильм S7. e, f Средние изображения проекции на глубине 144 и 482 мкм соответственно. Масштабные линейки: 250 мкм. Вставка с увеличенными областями, масштабные линейки: 50 мкм. См. Также Movie S8. г , репрезентативный временной ряд из 50 нейронов с усами. Возникновение раздражителя обозначено красными отметками.Смещение: 0,5 ΔF / F ₀ .

Наконец, используя нашу оптимизированную выборку латеральных вокселей ∼5 мкм, мы можем получить изображение объема ∼5,4 × 6,0 × 0,5 мм ³ , охватывающего оба полушария неокортекса мыши до глубины ∼600 мкм в ткани (рис. 5, фильмы S9 и S10, 5,4 × 6 × 0,5 мм ³ FOV). В этой модальности мы демонстрируем визуализацию Ca ²⁺ популяций 0,8 — 1,1 миллиона нейронов с разрешением одного нейрона и частотой звука 2,2 Гц (3 записи, N = 3 мыши, рис.S7b). На рис. 5 показана репрезентативная запись 807 748 нейронов, на которых можно четко обнаружить одиночные переходные процессы кальция (рис. 5e, Movie S11). Оптический доступ, большая степень мультиплексирования и оптимизированный подход к сканированию, используемые LBM, открывают дверь к масштабированию 2pM от отдельных областей мозга до записи всей коры, что позволяет исследовать двухполушарную когнитивную обработку, а также захватывать отдельные пробная динамика популяций нейронов в головном мозге млекопитающих более чем на 2 порядка больше, чем при использовании любого другого метода. ^{10, 23, 25, 29}

a , 3D-рендеринг извлеченных пространственных координат нейрона и максимальной прогнозируемой активности для 9-минутной записи. Поперечное изображение мозга воспроизведено из работы. 53. См. Также фильм S9. b , Y-Z проекция плотности нейронов; примерные границы между корковыми слоями обозначены зелеными линиями; все значения глубины отображаются относительно pia. c , Среднее проекционное изображение по записи на глубине 600 мкм. Масштабная линейка: 500 мкм. Вставка: увеличено в области c , масштабная линейка: 200 мкм. См. Также Movie S10. d , Тепловая карта всех 807 748 извлеченных нейронов, нормализованная до максимального значения ΔF / F ₀ . См. Также Movie S11. Подмножество из 10 примеров трассировок. Смещение: 1.0 ΔF / F ₀ . e , подмножество 3000 трасс от c показано в полном разрешении. f , подмножество из 50 трасс от e .Смещение: 0,5 ΔF / F ₀ .

Объемная химическая визуализация с помощью стимулированной проекционной микроскопии и томографии комбинационного рассеяния

Объемная визуализация на основе стимулированного комбинационного рассеяния

Обычно SRS-визуализация основана на двухмерном боковом сканировании сильно сфокусированных гауссовых лазерных лучей. Чтобы получить изображение через трехмерный объем, либо фокус лазера, либо образец необходимо перемещать в осевом направлении по одному изображению за шаг. Стек изображений, полученный по такой схеме, можно использовать для восстановления трехмерного объема, как показано на рис.1а. Для количественной оценки общего химического состава в объеме такая схема построения изображений с разделениями может потребовать много времени, особенно для большого объема, который требует восстановления множества срезов изображения. Луч Бесселя может оставаться сильно сфокусированным на большом расстоянии. Используя пучки Бесселя для возбуждения, сигнал ВКР может быть интегрирован в осевом направлении образца. Следовательно, сканирование пучков возбуждения Бесселя в двух измерениях на боковой плоскости может генерировать проекционное изображение, содержащее общее количество химических составов в объеме.Такой способ визуализации, называемый в данной статье SRP-микроскопией, проиллюстрирован на рис. 1b. Хотя микроскопия SRP позволяет проводить высокоскоростное количественное определение общего химического состава в объеме, она теряет осевое разрешение. Чтобы восстановить распределение химических компартментов в трехмерном объеме, мы дополнительно разработали томографию SRP, собирая серию изображений SRP при вращении образца и реконструируя трехмерную структуру с помощью алгоритмов восстановления изображения, как показано на рис. 1c.

( a ) Получение изображений в разрезе с помощью традиционной микроскопии с вынужденным комбинационным рассеянием света с гауссовым пучком. ( b ) Микроскопическое изображение с использованием стимулированной рамановской проекции (SRP) на основе пучков Бесселя. ( c ) Томографическая визуализация SRP на основе пучков Бесселя. ( d ) Генерация пучка Бесселя с помощью пары аксиконов и линзы объектива.

Теория генерации сигнала ВКР пучками Бесселя

Предполагая коллинеарно перекрывающиеся пучки накачки и Стокса, интенсивность ВКР от очень тонкой пластины с центром в позиции z и толщиной Δ z может быть выражена как ref.30

, где C ₀ — постоянная, Im ( χ ⁽³⁾ ) — мнимая часть нелинейной восприимчивости третьего порядка χ ⁽³⁾ и I _p ( z ) и I _S ( z ) — интенсивности пучков накачки и Стокса при z соответственно.

Сообщалось о нескольких методах создания пучка Бесселя ^31,32,33 . Здесь мы использовали два аксикона и линзу объектива для преобразования гауссова пучка в пучок Бесселя (рис.1г). В нашей реализации гауссов пучок сначала преобразовывался в кольцевой пучок парой аксиконов, а затем в пучок Бесселя через линзу объектива. Распределение интенсивности бесселевого луча можно смоделировать как

Здесь ( r , z ) — координаты в поперечном и продольном направлениях соответственно, I ₀ — интенсивность в центре падающий гауссов пучок с полушириной w ₀ « z _B — эквивалентная длина Рэлея бесселевого пучка, r _c — радиус кольцевого пучка, Δ d — ширина кольца, λ, — длина волны, а f — фокусное расстояние линзы объектива.

Выражая пучки накачки и Стокса с использованием выражения для пучка Бесселя в уравнении (2), мы получаем распределение интенсивности ВКР

, где C _B , β _p и β _S — константы, P _p ( z ) и P _S ( z ) — мощности накачки и стоксова пучка соответственно, J ₀ (·) — нулевая -порядок функции Бесселя.

Для толстого образца интенсивность сигнала SRP определяется как интегрирование I _bSRS ( r , z ) по толщине образца L

Общий сигнал SRP тогда равен

Здесь A — это область интегрирования сигнала, а Q — эффективность обнаружения фотодетектора. Вывод уравнений (1, 2, 3, 4, 5) подробно описан в дополнительных примечаниях 1–3.

Результаты моделирования сигнала SRP

На основе уравнений (2 и 3) были рассчитаны распределения интенсивности полей накачки, Стокса и ВКР.Во всех расчетах использовался объектив A × 10 с числовой апертурой (NA) 0,3. Как показано на рис. 2a – d, наш подход может генерировать ограниченные боковой дифракцией бесселевские пучки как для полей накачки, так и для стоксовых полей, которые демонстрируют высокоинтенсивный центральный лепесток с серией низкоинтенсивных колец. Такой профиль луча может выдерживать большое расстояние в направлении распространения лазерного луча. Например, центральный лепесток стоксова луча (на длине волны 1040 нм) имеет поперечный диаметр 4,02 мкм (дополнительный рис.1a) и может выдерживать расстояние распространения более 8,89 мм при полной ширине на полувысоте (FWHM) 3,79 мм (дополнительный рисунок 1b). Хотя кольца накачки и стоксова пучка могут частично перекрываться (дополнительный рис. 2а), интенсивность лазера в кольцах намного ниже, чем в центральном лепестке. Таким образом, нелинейным сигналом SRP, генерируемым частично перекрывающимися кольцами, можно пренебречь (дополнительный рис. 2b). Разумно предположить, что сигнал SRP возникает только из перекрывающихся центральных лепестков бесселевых лучей (рис.2д, е).

( a ) Поперечное и ( b ) продольное распределение интенсивности пучка накачки на длине волны 800 нм. Цветовая полоса такая же для a , b . ( c ) Поперечное сечение и ( d ) продольное распределение интенсивности стоксова пучка на длине волны 1040 нм.Цветовая полоса такая же для c , d . ( e ) Поперечное сечение и ( f ) продольные распределения интенсивности сигнала вынужденного комбинационного рассеяния (SRS), генерируемого около 2 885 см ^-1 . Цветовая полоса такая же для e , f . ( g ) Вынужденная рамановская проекция (SRP) и уровень сигнала SRS как функция толщины образца, предполагая, что входная мощность лазера одинакова для бесселевого и гауссова пучков.( h ) SRP и уровень сигнала SRS как функция толщины образца, предполагая одинаковую мощность лазера в центральном лепестке бесселевого луча и полную мощность гауссова луча. Красные сплошные кривые показывают сигнал SRP, генерируемый бесселевской накачкой и стоксовым пучком, а синие пунктирные кривые показывают сигнал SRS, генерируемый гауссовой накачкой и стоксовым пучком.

На рис. 2g, h показан уровень сигнала SRP как функция толщины образца, помещенного в центр фокуса, рассчитанный с использованием уравнения (5).Обнаружена линейная зависимость сигнала SRP от толщины образца в пределах 2,2 мм. Если толщина образца превышает 2,2 мм, такая линейность нарушается. Это связано с тем, что 2,2 мм — это продольная FWHM сигнала SRP. Мощность пучка Бесселя равномерно распределяется на центральный лепесток и кольца. Следовательно, плотность энергии в фокусе бесселевого пучка часто намного ниже, чем у гауссова пучка с той же общей входной мощностью. Следовательно, сигнал SRP, генерируемый пучками Бесселя, может быть намного ниже, чем сигнал SRS, генерируемый гауссовыми пучками, особенно когда образец тонкий (рис.2г). Для толстого образца сигнал от SRP может быть сравнимым или даже большим, чем сигнал SRS, генерируемый гауссовыми лучами, из-за большой длины интегрирования сигнала. Если мы предположим, что мощность в центральном лепестке бесселевого луча равна мощности в гауссовом фокусе, сигнал SRP, генерируемый бесселевыми лучами, всегда больше, чем сигнал SRS от гауссовых лучей (рис. 2h).

Далее мы рассчитали зависимость сигнала SRP от мощности лазера, которая показала положительный линейный рост, как видно на дополнительном рис.3. Мы также исследовали влияние числовой апертуры объектива и увеличения на рэлеевскую длину бесселевского луча, размер центрального лепестка, общий сигнал SRP и продольную FWHM сигнала SRP. Как показано на дополнительном рисунке 4, больший сигнал SRP может быть получен с помощью объективов с меньшим увеличением и большей числовой апертурой. Кроме того, для конкретной NA сигнал SRP уменьшался с большим увеличением. Однако для конкретного увеличения было оптимальное значение NA для генерации максимального сигнала SRP для каждой толщины образца.Кроме того, мы обнаружили, что и рэлеевская длина бесселевого луча (дополнительный рис. 5a), и продольная FWHM сигнала SRP (дополнительный рис. 5b) уменьшались с большим увеличением (зафиксируйте значение NA) или NA (зафиксируйте значение NA) значение увеличения). Для бесселевой микроскопии SRP размер центрального лепестка определяет разрешение системы, которое не зависит от величины увеличения (дополнительный рис. 6a), но обратно зависит от значения числовой апертуры (дополнительный рис. 6b). Результаты нашего моделирования могут помочь выбрать оптимальную цель для конкретных приложений визуализации SRP.

Микроскоп SRP

Схема нашего микроскопа SRP изображена на рис. 3. Два синхронизированных луча генерировались импульсным лазером (InSight DeepSee, Spectral Physics) с частотой следования 80 МГц. Один луч имел фиксированную длину волны 1040 нм и использовался в качестве стоксова луча. Другой луч имел настраиваемую длину волны от 680 до 1300 нм и использовался в качестве луча накачки. Стоксов пучок модулировался на частоте 2,5 МГц с помощью акустооптического модулятора (1205-C, Isomet). Луч накачки сначала задерживался поступательным каскадом, а затем пространственно и временно объединялся с пучком Стокса с помощью дихроичного зеркала.Два аксикона (AX2520-B, Thorlabs) использовались для преобразования перекрывающихся гауссовых лучей в кольцевые лучи. После уменьшения размера луча с помощью системы линз 4- f кольцевые лучи направлялись в 2D-гальваническую систему (GVS012, Thorlabs) для лазерного сканирования. После отражения двухмерной гальванической системой и расширения с помощью другой системы линз 4- f сканированные кольцевые лучи направлялись на линзу объектива для генерации лучей Бесселя.

Перестраиваемый импульсный лазер обеспечивает две синхронизированные последовательности фемтосекундных импульсов в качестве пучка накачки и стоксова пучка. Пучок Стокса модулируется АОМ. Луч накачки сначала задерживается поступательным каскадом, а затем пространственно и временно объединяется с пучком Стокса с помощью DM. Коллинеарно перекрывающиеся лучи направляются на пару аксиконов для создания кольцевых лучей. Регулируя размер луча, кольцевые лучи сначала направляются в двухмерную гальваническую систему для лазерного сканирования, а затем направляются к объективу для генерации бесселевых лучей.После пробы прошедшие пучки Бесселя собираются конденсатором и затем направляются на ФД. Пара короткопроходных фильтров закреплена перед ФД для удаления состава стоксова пучка. Фототок, генерируемый в PD, усиливается резонансным усилителем, созданным в лаборатории, и затем направляется на синхронизирующий усилитель для извлечения сигнала. А, аксикон; АОМ — акустооптический модулятор; DM — дихроичное зеркало; HWP, полуволновая пластина; L, линза; М, зеркало; PBS, поляризационный светоделитель; ПД, фотодиод.

Система линз 4- f была создана для создания сопряженной плоскости гальванической системы на входе в объектив и для расширения кольцевых лучей, чтобы они соответствовали входному зрачку линзы объектива.После образца мы использовали водный иммерсионный объектив × 60 (UPlanSApo × 60, NA = 1,2, Olympus) для сбора прошедших лучей Бесселя. Такой объектив с высокой числовой апертурой обеспечивал высокую эффективность сбора сигналов, предотвращая перекрестную фазовую модуляцию фона изображения. Переданные лучи сначала фильтровались парой короткопроходных фильтров (ET980SP-2P, Chroma) для удаления состава стоксова луча, а затем направлялись на кремниевый фотодиод большой площади (S3994-01, Hamamatsu). Фототок, генерируемый фотодиодом, сначала усиливался лабораторным резонансным усилителем, а затем отправлялся на синхронизирующий усилитель (SRS844, Stanford Research Systems или MFLI, Zurich Instruments) для дальнейшего усиления и извлечения сигнала.

Чтобы облегчить сравнение между микроскопом SRS с гауссовым лучом и микроскопом SRP с бесселевым лучом, мы построили дополнительную оптическую руку, чтобы позволить лазерным лучам обходить аксиконы, как показано пунктирными линиями на рис. 3. С помощью перевернутых зеркал , система может быстро переключаться между схемами Бесселя SRP и гауссовой SRS.

Характеристики микроскопа SRP

Сначала мы проверили результаты моделирования пучков Бесселя с использованием объектива × 10 с NA = 0,3.Для стоксова луча на длине волны 1040 нм диаметр центрального лепестка и осевая полуширина продольного распространения были измерены и составили 4,13 мкм и 3,34 мм соответственно (дополнительный рисунок 7). Эти значения полностью совпадают с расчетами.

Далее мы охарактеризовали работу микроскопа SRP. Для исследования зависимости сигнала SRP от толщины образца и входной мощности лазера были приготовлены пленки полидиметилсилоксана (PDMS) различной толщины.На рисунке 4а показано, что сигнал SRP линейно возрастает с увеличением толщины образца в миллиметровом диапазоне ( R ² = 0,9977). Кроме того, сигнал SRP линейно зависел от мощности как накачки ( R ² = 0,9998), так и стоксова ( R ² = 0,9980) лучей (рис. 4b, c). Шум, с другой стороны, был пропорционален квадратному корню из мощности накачки (рис. 4d), что указывало на обнаружение сигнала, ограниченного дробовым шумом лазера.

( a ) Измеренный сигнал вынужденной рамановской проекции (SRP) от пленок PDMS как функция толщины образца. Красная линия — это линейная аппроксимирующая кривая для измеренных точек данных ( R ² = 0,9977). ( b , c ) Сигнал SRP PDMS в зависимости от мощности Стокса ( b ) и мощности накачки ( c ). Красные линии — это линейные аппроксимирующие кривые для измеренных точек данных ( R ² = 0.9980 для мощности Стокса и R ² = 0,9998 для мощности накачки). ( d ) Шум SRP как функция мощности накачки. Красная кривая — результат аппроксимации измеренных точек данных ( R ² = 0,9931). ( e ) Отношение сигнал / шум (SNR) микроскопии SRP как функция концентрации образца. Красная линия — это линейная аппроксимация точек измеренных данных ( R ² = 0,9994). ( f ) Спектр SRP ДМСО в D ₂ O при концентрации 21.84 мМ.

Затем мы оценили чувствительность микроскопа SRP, измерив симметричное растяжение CH ₃ при 2915 см ^-1 для диметилсульфоксида (ДМСО), разбавленного оксидом дейтерия (D ₂ O). Толщина образца составляла 2 мм, что меньше продольной FWHM пучков Бесселя, генерируемых объективом × 10. Мощность накачки и Стокса на центральном лепестке бесселевых пучков составляла 0,7 и 30 мВт соответственно. На рис. 4e показано измеренное отношение сигнал / шум в зависимости от концентрации ДМСО.Эти результаты показали предполагаемый предел обнаружения 21,84 мМ ДМСО при одночастотном измерении SRP. Из измерения спектра, которое может еще больше повысить чувствительность системы, мы можем четко выделить пик от 21,84 мМ ДМСО (рис. 4f) и достичь предела обнаружения 1,8 мМ ДМСО. Мы также измерили рамановский переход C = C на расстоянии 1583 см ^-1 от ретиноевой кислоты, что дало предел обнаружения всего 100 мкМ (дополнительный рис. 8). Этот результат подтвердил микромолярную чувствительность нашего микроскопа SRP в области рамановских отпечатков пальцев.

Микроскопическое изображение SRP

Чтобы доказать способность нашего микроскопа SRP быстро определять количество химических веществ в объеме, мы визуализировали полистирольные шарики, диспергированные в трехмерной матрице агарозного геля, и сравнили изображения SRP с изображениями SRS-срезов, полученными по гауссовой схеме. . Из изображений SRS с гауссовым пучком можно увидеть только часть гранул в каждой плоскости сечения (рис. 5а). Чтобы отобразить все шарики в трехмерном объеме, в течение 20 секунд была получена серия секционных изображений (50 изображений, 2 мкм на шаг, как показано в дополнительном фильме 1).Наложение разрезов изображений с выбранных глубин показано на рис. 5b. На изображении SRP, полученном в том же месте, все частицы в объеме могут быть разрешены с помощью одного двухмерного бокового сканирования, завершенного за 2 с (рис. 5c, d), что на порядок быстрее, чем получение изображения в разрезе. Такое преимущество в скорости может быть увеличено для получения изображения еще большего объема. Мы также визуализировали смесь шариков из полистирола диаметром 10 и 100 мкм (дополнительный рис. 9). Было обнаружено, что интенсивность сигнала SRP от бусинок 100 мкм примерно в 10 раз выше, чем у бусинок 10 мкм (оба измерены в центральной части бусинок).Этот результат еще раз подтвердил пригодность нашего микроскопа SRP для количественной химической оценки.

( a ) Сечения изображений, полученных с помощью микроскопа с гауссовым пучком стимулированного комбинационного рассеяния (ВКР) на разных глубинах объема образца. ( b ) Наложение секционных изображений в a . Искусственными цветами изображены бусинки, расположенные на разной глубине. Изображения одних и тех же гранул с помощью стимулированной рамановской проекции (SRP), полученные при включенном ( c ) и выключенном ( d ) резонансе комбинационного рассеяния.Время пребывания пикселя составляло 10 мкс для изображения SRS и 50 мкс для изображения SRP. Масштабные линейки 30 мкм.

В качестве примера для количественной оценки биомолекул мы визуализировали липидные капли (LD) в дифференцированных клетках 3T3-L1. Мы настроили рамановский переход на симметричное колебание CH ₂ на высоте 2850 см ^-1 , чтобы отобразить ЛД. Клетки имеют форму, близкую к сферической, диаметром до десятков микрометров. Сначала мы получили 50 изображений клеток в разрезе с помощью микроскопа SRS с гауссовым лучом с шагом 1 мкм на глубину.Общее время получения изображения 45 с. На рис. 6а показаны изображения в разрезе на глубине z = 20, 30 и 40 мкм, демонстрирующие очень разные внутриклеточные морфологии LD. На рис. 6b показано наложение 50 изображений в разрезе, представляющих общее содержание липидов в клетке. С другой стороны, SRP-изображение той же клетки напрямую выявило такую ​​глобальную информацию о липидах с помощью одного двухмерного бокового сканирования, выполненного всего за 0,9 с (рис. 6c, d), давая морфологию и профиль интенсивности, аналогичные профилям суперпозиции. изображение (рис.6б). Этот пример дополнительно подчеркнул преимущество скорости использования микроскопии SRP для количественной оценки глобальной информации о биомолекулах в объеме.

( a ) Изображения в разрезе, полученные с помощью микроскопа вынужденного комбинационного рассеяния света (ВКР) с гауссовым пучком на разной глубине образца. ( b ) Наложение 50 секционных изображений. Изображения стимулированной рамановской проекции (SRP) одной и той же ячейки, полученные при включенном ( c ) и выключенном ( d ) резонансе комбинационного рассеяния.Время пребывания пикселя составляло 10 мкс для изображений SRS и SRP. Профили сигналов по пунктирным линиям отображались в правом нижнем углу изображений. Масштабные линейки 30 мкм.

Томографическая визуализация SRP

Хотя микроскопия SRP может количественно определять химические вещества или биомолекулы в объеме с высокой скоростью, она теряет осевое разрешение. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали томографический метод на основе SRP для восстановления трехмерного распределения биомолекул в объеме с оптическим разрешением.В этом томографическом методе проекционные изображения собирались при повороте образца на 1 ° на шаг в течение 180 шагов. Затем 180 проекционных изображений были собраны для восстановления трехмерной информации в объеме изображения. Сначала мы написали код реконструкции, а затем проверили код с помощью моделирования. Имитационная модель содержала четыре объекта, которые генерировали сигналы, как показано на дополнительном рисунке 10. Стек изображений SRP был сформирован путем вращения образца вокруг главной оси цилиндрического объема (вдоль направления z ) при проецировании объектов на плоскость. по оси.Затем местоположение и распределение объектов были восстановлены из стека изображений SRP с помощью алгоритма отфильтрованной обратной проекции (FBP) ³⁴ . Восстановленный трехмерный объем и соответствующие изображения поперечного сечения из поперечного, коронарного и сагиттального видов показаны в дополнительном фильме 2 и дополнительном рисунке 11, демонстрируя хорошее согласие с исходными объектами (дополнительный рисунок 10).

Экспериментально мы визуализировали трехмерное распределение шариков полиметилметакрилата (ПММА) (10 мкм) в агарозном геле.Лазер был настроен на возбуждение рамановского перехода на высоте 2950 см ^-1 от колебания CH ₃ . Образец загружали в цилиндрическую капиллярную трубку (диаметром 50 мкм), закрепленную на вращающемся столике. Образец последовательно поворачивали на 180 ° с шагом 1 ° за шаг. Затем на каждом этапе собирали SRP-изображения шариков. Реконструированный объем имел размер около 60 × 60 × 60 мкм ³ . На восстановленном томографическом изображении размер и расположение шариков были хорошо разрешены (дополнительный фильм 3).Кроме того, достоверность томографической реконструкции была подтверждена с помощью восстановленного объема из изображений сечений, полученных с помощью SRS сечения изображения на тех же гранулах с помощью гауссова луча. Восстановленный трехмерный объем шариков ПММА с помощью сечения изображений показан в дополнительном фильме 4. Для прямого сравнения мы выбрали соответствующие срезы (в корональной и сагиттальной проекциях) шариков, визуализированных с использованием обоих методов, как показано на рис. 7 Хотя пространственное разрешение несколько снизилось, результаты томографии SRP хорошо согласуются с результатами визуализации SRS срезов с точки зрения морфологии и локализации.Сферическую форму шариков можно хорошо реконструировать с небольшими искажениями, что было доказано путем сравнения профилей шариков по трем осевым направлениям, как показано на дополнительном рис. 12.

( a , b ) Выбранные срезы изображений шариков из ПММА в различных положениях в сагиттальной проекции (плоскость yz ).( c , d ) Выбранные фрагменты изображения из тех же гранул в корональной проекции (плоскость xz ). ( a , c ) Изображения, восстановленные с помощью томографии с использованием стимулированной рамановской проекции (SRP). ( b , d ) Сечения изображений, полученных с помощью микроскопа с гауссовым пучком стимулированного комбинационного рассеяния (SRS). Полученный объем составлял ∼60 × 60 × 50 мкм ³ для SRS сечения изображения и 60 × 60 × 60 мкм ³ для томографического изображения SRP.Время пребывания пикселя составляло 10 мкс для SRS сечения изображения и 24 мкс для томографического изображения SRP. Шкала 10 мкм.

Томография SRP имеет большее преимущество в скорости визуализации при измерении большего объема. В качестве примера мы изобразили шарик полистирола размером 100 мкм в объеме ∼320 × 320 × 320 мкм ³ . Восстановленный трехмерный объем с помощью томографии SRP показан в дополнительном фильме 5. Точность восстановления томографии SRP была снова подтверждена сравнением одного из трехмерных изображений в разрезе с соответствующим изображением, полученным с помощью SRS-изображения с помощью гауссова луча (дополнительный рис.13). При использовании томографии SRP потребовалось 47 с для получения стопки изображений SRP из 180 проекций. Однако при использовании метода построения изображений с использованием SRS с использованием гауссова луча требуется 723 сечения, что составляет 188 с, чтобы получить трехмерное изображение такого большого объема. В этом случае наша томография SRP выполняется в четыре раза быстрее, чем метод секционирования. Для получения изображений еще большего объема, когда требуется больше изображений в разрезе для восстановления объемной структуры, преимущество томографии SRP в скорости визуализации будет еще больше проявлено.Отметим, что скорость изображения, рассчитанная здесь, рассчитана для одного рамановского сдвига. Регулируя длину волны луча накачки, можно визуализировать различные рамановские сдвиги. Настройка лазера может быть достигнута за десятки миллисекунд в диапазоне 200 см ^-1 или за секунды в большем диапазоне в 4 000 см ^-1 (ссылка 35).

Затем мы выполнили томографию SRP на отдельных дифференцированных клетках 3T3-L1, чтобы изучить потенциал этого метода для 3D in vivo визуализации биомолекул.Лазер был настроен на возбуждение вибрации CH ₂ на высоте 2850 см ^-1 . На рис. 8a показано реконструированное трехмерное распределение липидов в клетке, а полное трехмерное изображение отображается в дополнительном фильме 6. Выбранные срезы на сагиттальном и поперечном представлениях отображают различные распределения липидов и показаны на рис. 8b, c, соответственно. . Такое распределение липидов также было выявлено на изображениях сечения SRS в поперечном виде (дополнительный рисунок 14), показывая хорошее согласие с результатами томографии, за исключением небольших различий в тонких структурах, возможно, вызванных различиями в разрешении системы, несоответствиями в глубине изображения и несогласованностью. в ориентации образца.Пространственное разрешение томографических изображений SRP было немного ниже, чем у изображений в разрезе SRS, что вызвано более низкой эффективной числовой апертурой при измерении SRP (∼0,88 в SRP Бесселя и ∼1,07 в SRS по Гауссу). Эти результаты подтвердили применимость томографии SRP для in vivo визуализации биомолекул в трехмерном объеме.

( a ) Реконструированная трехмерная структура ячейки 3T3-L1.( b ) Выбранные срезы изображения ячейки 3T3-L1 в разных положениях в сагиттальной проекции (плоскость yz ). ( c ) Изображения из той же ячейки в поперечном виде (плоскость xy, ). Изображаемый объем составлял ∼150 × 150 × 150 мкм ³ . Время пребывания пикселя составляло 10 мкс. Масштабные линейки, 20 мкм.

Многоклеточная многоцветная визуализация со сверхвысоким разрешением с использованием объемной мультифокусной микроскопии

Значение

Основной проблемой современных биологических исследований является определение трехмерной молекулярной архитектуры клеточных органелл.В последние годы значительный прогресс в наноразмерной визуализации был достигнут благодаря появлению оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Однако многие методы сверхвысокого разрешения по-прежнему ограничиваются сбором 2D. Здесь мы демонстрируем объемный подход к визуализации сверхвысокого разрешения, основанный на одновременном отображении нескольких плоскостей образца с помощью мультифокальной микроскопии. Глубина, на которой могут быть реконструированы структуры, достигает 4 мкм, что сравнимо с толщиной многих клеточных органелл или даже целых клеток.

Abstract

Визуализация сверхвысокого разрешения на основе одиночных молекул стала важным инструментом в современной клеточной биологии. Из-за ограниченной глубины резкости систем оптической визуализации одна из основных проблем при визуализации со сверхвысоким разрешением заключается в захвате трехмерной наноразмерной морфологии всей клетки. Несмотря на многие предыдущие попытки расширить применение методов фотоактивированной микроскопии локализации (PALM) и микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) в трех измерениях, эффективная глубина локализации обычно не превышает 1.2 мкм. Таким образом, трехмерная визуализация целых клеток (или даже крупных органелл) по-прежнему требует последовательного получения изображений в различных аксиальных положениях и, следовательно, страдает от комбинированных эффектов активации расфокусированных молекул (повышенный фон) и обесцвечивания (потеря обнаружения). Здесь мы представляем использование многофокусной микроскопии для получения объемных многоцветных изображений со сверхвысоким разрешением. За счет одновременной визуализации девяти различных фокальных плоскостей мультифокусный микроскоп мгновенно фиксирует распределение отдельных молекул (флуоресцентных белков или синтетических красителей) в объеме глубиной ∼4 мкм с точностью латеральной и осевой локализации ∼20 и 50 нм соответственно. .Возможности мультифокусной микроскопии быстро отображать трехмерную организацию внутриклеточных структур иллюстрируются визуализацией митохондриальной сети млекопитающих и микротрубочек дрожжей во время деления клеток со сверхвысоким разрешением.

Из-за своей специфичности и способности отображать живые образцы флуоресцентная микроскопия является наиболее широко используемым инструментом визуализации для биологических исследований. В последние годы было внедрено несколько методов повышения разрешающей способности флуоресцентной микроскопии за пределами дифракционного предела (1, 2).Эти методы включают истощение стимулированного излучения (3), структурированное освещение (4) и микроскопию локализации одиночных молекул (LM) (5, 6). В последнем подходе точный контроль условий освещения делает возможной редкую активацию отдельных флуоресцентных молекул, позволяя определять их положение с точностью до нескольких десятков нанометров. Последовательная фотоактивация, визуализация и обесцвечивание (или фотопереключение) большого количества флуорофоров затем позволяют реконструировать исследуемую структуру, воплощая принципы фотоактивированной локализационной микроскопии (PALM) (5), флуоресцентной фотоактивационной микроскопии локализации (FPALM). ) (7) и микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) (6, 8).

LM-методы вызвали значительный интерес в биологических исследованиях (9, 10), но по-прежнему преимущественно реализуются с использованием микроскопии с затухающими волнами (или флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения) (11), что ограничивает их применение двумерными или тонкими структурами, близкими к клетке. мембрана. Однако во многих биологических контекстах очень желательно получить доступ к трехмерной внутриклеточной организации клетки с субдифракционным разрешением.

Для эффективного 3D LM в культивируемых клетках необходимо решить две проблемы.Во-первых, одиночные молекулы должны быть локализованы с субдифракционной точностью как в латеральном, так и в осевом направлении. Во-вторых, осевая глубина, на которой выполняются локализации, должна быть сопоставима с толщиной всей клетки. Подходы, разработанные для решения первой проблемы, обычно основываются на шифровании осевой информации в 2D-изображениях путем разработки функции рассеяния точки (PSF) микроскопа (8, 12⇓⇓ – 15), однофотонной интерферометрии (16) или биплановой визуализации. (17⇓ – 19). Однако типичная глубина визуализации большинства этих методов не превышает 1.2 мкм и, следовательно, недостаточно для визуализации целых клеток. Кроме того, из-за конфигурации возбуждения с широким полем, преимущественно используемой для визуализации в 3D LM, активация и испускание расфокусированных молекул приводит к увеличению фона на флуоресцентном изображении и их ненужному обесцвечиванию (Рис. 1 A и В ). Другими словами, информация за пределами плоскости формирования изображения теряется, в то время как отношение сигнал / шум в изображении снижается. Селективное возбуждение плоскости (20) или активация (21, 22) может обойти эту проблему, но требует последовательного сканирования для изображения всего объема клетки.

Сравнение между обычным широкопольным детектированием и мультифокусным детектированием. ( A и B ) Весь объем возбуждается в конфигурации с широким полем, и флуоресценция расфокусированных молекул составляет фон зарегистрированного сфокусированного сигнала. ( C и D ) В мультифокусной конфигурации трехмерная протяженность PSF используется для локализации молекул в объеме, поскольку информация получается из нескольких фокальных плоскостей.

Мы сообщаем об успешной реализации объемного метода сверхразрешения PALM / STORM, который позволяет избежать вышеупомянутых проблем. Наш метод основан на недавно разработанном мультифокусном микроскопе (MFM) (23), который обеспечивает одновременное получение девяти равноотстоящих фокальных плоскостей (рис.1 C и D ) на одной камере за счет комбинации специальной дифракционной решетки. и элементы хроматической коррекции, размещенные в эмиссионном тракте микроскопа (рис.2). Расстояние между последовательными фокальными плоскостями составляет ~ 440 нм, что обеспечивает точную трехмерную локализацию одиночных флуоресцентных молекул с трехмерной гауссовой аппроксимацией полученных PSF. Мы показываем, что такое объемное получение совместимо с двухцветной визуализацией PALM / STORM со сверхвысоким разрешением клеток млекопитающих и дрожжей с точностью латеральной и осевой локализации ~ 20 и 50 нм, соответственно. Глубина визуализации составляет ~ 4 мкм, что значительно превышает возможности других методов трехмерного сверхразрешения (обзор в ссылке 24), и, в частности, позволяет получить полное трехмерное изображение многих клеточных органелл или целых клеток (фильмы S1 и S2).

MFM. Лазеры возбуждения объединены в волокне через акустооптический перестраиваемый фильтр, коллимированы, отражены на дихроичном зеркале (DM) и сфокусированы на задней апертуре высокоинтенсивного NA. цель — добиться возбуждения в широком поле. Собранное излучение проходит через DM и проходит через MFG, расположенный в плоскости, сопряженной с плоскостью заднего зрачка объектива. Порядки дифракции проходят через модуль хроматической коррекции, а затем отдельно фокусируются на детекторе.Для регистрации дрейфа образца и предметного столика гранулы полистирола (диаметром 4 мкм) были иммобилизованы на покровном стекле, освещены инфракрасным светоизлучающим диодом (IR LED), и их дифракционная картина была записана с помощью инфракрасной камеры (IR CAM) через дополнительный светоделитель, вставленный в тракт излучения. Графики представляют собой записанные положения борта по осям x и z . ( Нижняя вставка ) Пример испускания молекул, записанных в различных плоскостях z , соответствующих меченым нуклеопорам (необработанные данные находятся в Movie S1, а восстановленное изображение — в Movie S2).(Шкала: 5 мкм.)

Результаты

Точность локализации.

Сначала мы исследовали зависимость точности локализации от расстояния между последовательными плоскостями при использовании MFM. Для этого были получены изображения флуоресцентных шариков с длиной волны 200 нм, иммобилизованных на покровном стекле, с использованием четырех различных мультифокусных решеток (MFG), соответствующих межплоскостному расстоянию (Δz) 110, 220, 440 и 880 нм (при λ = 670 нм) ( Рис.3 A ). Столик микроскопа сдвигался с шагом 60 нм (120 нм для случая шага 880 нм) вдоль оптической оси, и за один шаг снималось 20 кадров (рис.3 В ). Интенсивность возбуждения и параметры получения изображения были отрегулированы так, чтобы сигнал шарика был сравним с сигналом отдельного флуорофора при получении PALM / STORM. Для каждого кадра сигнал был подогнан трехмерной интегрированной функцией Гаусса ( SI Text и рис. S1), и SD оцененных положений вычислялось для каждого шага. Для всех решеток с Δz менее 500 нм мы наблюдали, что точность осевой локализации была менее 50 нм на полной (9 × Δz) глубине изображения (рис.3 C и рис. S2).

Характеристика 3D MFM. ( A ) Относительное положение в фокусе последовательных плоскостей z для образца дифракционных решеток MFM, испытанных на расчетной длине волны 515 нм. Подтверждено, что расстояние составляет 880, 440, 220 и 110 нм для решеток I, II, III и IV соответственно. ( B ) Измерения осевого положения флуоресцентных шариков 200 нм по сравнению со смещением пьезоэлектрического столика. Было получено 20 кадров в каждой позиции предметного столика, и локализация валика по оси z была выполнена, как описано в тексте.Превосходное соответствие между положением столика и экспериментально обнаруженной локализацией шарика очевидно в диапазоне ~ 4 мкм при использовании решетки II (расстояние 440 нм). ( C ) SD осевой локализации флуоресцентных шариков в зависимости от положения z , записанное с помощью решеток с различным шагом. ( D ) Относительные положения в фокусе последовательных плоскостей z измеряются для решетки II на трех разных длинах волн. ( Врезка ) Зависимость расстояния между плоскостями этой решетки от длины волны.( E ) Распределение точности латеральной локализации (SD) флуоресцентных шариков, отображаемых в 2D-конфигурации с широким полем с использованием 2D-подгонки по Гауссу (среднее значение = 2,6 нм). ( F ) Распределение точности латеральной локализации одних и тех же шариков, отображаемых в конфигурации MFM и локализованных с помощью двумерной подгонки по Гауссу с использованием только одной (в фокусе) плоскости изображения (среднее значение = 13 нм). ( G ) Распределение точности латеральной локализации, полученное с помощью трехмерной гауссовой аппроксимации того же изображения MFM, что и в F (среднее значение = 9 нм).

Для получения многоцветных изображений со сверхвысоким разрешением решетка MFM используется на длинах волн, отличных от проектного значения (∼515 нм), что влияет на общую дифракционную эффективность и однородность между порядками дифракции. На практике первый эффект приводит к умеренному снижению отношения сигнал / шум, тогда как последний эффект может быть компенсирован с помощью процедуры после сбора данных ( Methods , System Calibration and Data Analysis ). Кроме того, использование дифракционных решеток приводит к хроматической дисперсии, которая, если ее не учитывать, может привести к хроматической аберрации.Хотя поперечная хроматическая дисперсия эффективно корректируется с помощью светящейся решетки и призмы, размещенных после MFG вдоль пути излучения, осевая хроматическая дисперсия проявляется как изменение эффективного Δz между последовательными плоскостями.

В плоскости Фурье системы формирования изображения волновой фронт света на длине волны λ, исходящий от излучателей, расположенных на осевом расстоянии Δz от фокальной плоскости в среде с показателем преломления n _λ , характеризуется фазой профиль сдвига, масштабируемый как (2π / λ) nλΔz (25).Искажение MFG действует на волновой фронт излучения, чтобы уравновесить этот профиль фазового сдвига (23). Индуцированный фазовый сдвиг масштабируется как (2π / λ) nλaΔz ( a — целое число от -4 до +4, характерное для порядка дифракции). Осевое положение Δz и длина волны включены в конструкцию решетки. Получение изображений на другой длине волны приводит к небольшому изменению скорректированного профиля фазового сдвига, который, в свою очередь, соответствует другому осевому положению. Как показано экспериментально на рис.3, для данной решетки эффективная Δz линейно масштабируется с длиной волны ( SI Text имеет полный аналитический вывод).

Для достижения совместной регистрации различных спектральных каналов, многоцветные шарики визуализировались последовательно через разные фильтры во время пошаговых осевых смещений. Затем были вычислены отдельные матрицы пространственного преобразования Δz и дифракционная эффективность, которые использовались в качестве калибровки для повторного выравнивания стопок изображений в различных спектральных каналах.Мы оцениваем общую точность регистрации двух цветов как лучше, чем 10 нм в латеральном направлении и 30 нм в осевом направлении ( SI Text и рис. S3 и S4).

По сравнению с отображением одной плоскости, неизбежным недостатком многоплоскостного обнаружения является более низкое отношение сигнал / шум, поскольку общее количество фотонов разделено между различными плоскостями изображения. Из-за потерь, вызванных элементами мультифокальной решетки (дифракционная эффективность 65%) и хроматической коррекции (эффективность 85% на длине волны изображения), мы оцениваем, что ∼5% испускаемых фотонов детектируется в каждой из девяти плоскостей (на длине волны 670 нм). длина волны).Таким образом, SD положения бокового излучателя, как ожидается, увеличится на 20. Чтобы исследовать последствия разделения сигнала, мы визуализировали флуоресцентные шарики на нескольких сотнях кадров с использованием MFM, а также с одноплоскостной конфигурацией, где все возбуждение и параметры сбора были идентичны. Мы сравниваем SD латеральной локализации для обоих сценариев на рис. 3 E – G . Как и ожидалось, расщепление значительно снижает точность латеральной локализации, когда плоскости анализируются по отдельности (рис.3 E в сравнении с рис. 3 F ). Тем не менее, MFM позволяет выполнять выборку PSF в различных фокальных плоскостях z , что эффективно улучшает боковую SD на квадратный корень из числа плоскостей выборки. При интервале 440 нм PSF обычно отображается в двух плоскостях, что указывает на улучшение на 2, что было подтверждено экспериментально на рис. 3 G . Поэтому шаг решетки 440 нм был выбран как хороший компромисс между точностью и глубиной изображения (∼4 мкм) (рис.3 С ).

Визуализация сети митохондрий в клетках HeLa.

Чтобы проверить надежность и производительность 3D-микроскопии сверхразрешения MFM, мы сначала применили ее к визуализации STORM митохондрий в клетках HeLa, трансфицированных TOM20 (транслоказой внешней митохондриальной мембраны), слитой с GFP. После фиксации параформальдегидом (PFA) TOM20-GFP был помечен конъюгатом нанотело анти-GFP – Alexa 647 (26) в присутствии поглотителя кислорода ( SI Text ). Для достижения разреженного обнаружения (∼0.08 молекул / мкм ² на кадр), использовался маломощный 488-нм (или 405-нм) лазер вместе с мощным 640-нм лазерным освещением (1 кВт / см ² ). Поскольку для получения изображений в STORM требуется сбор данных в течение длительного времени (∼15 мин), мы скорректировали тепловой дрейф микроскопа. С этой целью мы использовали изготовленную на заказ систему отслеживания образца, которая анализирует дифракционные кольца шарика размером 4 мкм, прикрепленного к покровному стеклу образца, и находит его центр с точностью до 1 нм в диапазонах x / y и 5 нм. в z (27, 28) (рис.S5 – S7). На рис. 4 показано типичное сверхразрешенное изображение митохондрий на глубине ∼4 мкм, реконструированное с локализацией ∼10 ⁶ молекул, обнаруженных более чем на 30 000 кадров. Обратите внимание, что сопоставимые глубины визуализации недостижимы с помощью других методов, если не используется последовательное сканирование z в сочетании с селективным освещением плоскости (20, 21). Чтобы напрямую оценить точность локализации для отдельных красителей Alexa 647 (связанных с белками TOM20) в наших условиях визуализации и образцов, мы выделили одиночные молекулы, которые распространились на несколько последовательных кадров.Мы обнаружили, что точность локализации составляла 16 нм по латерали и 35 нм по оси в диапазоне глубины обнаружения ( SI Text и рис. S8 – S10). Изображение, полученное с помощью программы трехмерной реконструкции / визуализации со сверхвысоким разрешением ViSP (29), показывает сильно взаимосвязанную пространственную сеть митохондрий, которая особенно плотно прилегает к ядру клетки (рис. 4 C , нижний левый угол и фильмы S3– S5). Из-за непрерывного деления и слияния в живых митохондриях такие сети постоянно меняют свою форму; Точность локализации 3D MFM была достаточной, чтобы четко различить внешнюю мембрану митохондрий в латеральном и осевом направлениях, разделенных 230 и 208 нм соответственно (рис.4 F – H ).

Мультифокальное сверхразрешенное (MFM STORM) изображение митохондрий. Клетки HeLa, экспрессирующие TOM20 – GFP, метили конъюгатом Alexa 647 нанотела против GFP. ( A ) Изображение, записанное широкопольным MFM. (Шкала: 5 мкм.) ( B ) Изображение, записанное MFM STORM. Одиночные флуорофоры Alexa 647 обнаруживаются в разных фокальных плоскостях. (Масштаб: 5 мкм.) ( C ) Восстановленное трехмерное изображение со сверхвысоким разрешением (глубина кодируется цветом) (фильмы S3 – S5).Локализации представлены в виде изотропных трехмерных гауссовских профилей 20-нм SD с использованием программы трехмерной реконструкции со сверхвысоким разрешением ViSP (29). (Масштаб: 2 мкм.) ( D и E ) Увеличенный вид области 1 в C , показывающий вид сбоку и ось соответственно. (Масштаб: 500 нм.) ( F и G ) Профиль плотности обнаружения структуры 2 в C , нанесенный в поперечном и осевом направлениях соответственно. ( H ) Поперечное сечение структуры, показанной в F и G , показывающее просвет митохондрий (стрелка = 100 нм).

Визуализация дрожжей.

Во втором примере мы применили подход 3D MFM PALM / STORM к почкующимся клеткам дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ). Несмотря на их частое использование в качестве модельной системы в клеточной биологии, дрожжевые клетки редко визуализируются с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения (26). В частности, их округлая форма и толстая клеточная стенка представляют собой серьезное препятствие для приложений PALM, что делает невозможным получение изображений в режиме полного внутреннего отражения. Глубина визуализации MFM почти соответствует размеру дрожжевых клеток ~ 5 мкм и, таким образом, идеально подходит для визуализации целых клеток со сверхвысоким разрешением.Мы генетически ввели фотоконвертируемую метку tdEos (тандемная димерная форма флуоресцентного белка Eos) на С-конце одного из генов α-тубулина в диплоидном штамме. Затем фиксированные PFA клетки покрывали конъюгатом конканавалин A-Alexa 647 для мечения клеточных стенок. Данные двухцветного сверхразрешения получали последовательно. Сначала Alexa 647 переводили [в присутствии 100 мМ гидрохлорида цистеамина (MEA)] в темное состояние с интенсивным освещением 640 нм. Во-вторых, отдельные молекулы Alexa 647 наблюдались во время их временного возврата в флуоресцентное состояние (режим STORM).После получения ~ 20000 кадров (когда флуоресцентные события Alexa 647 стали редкими), мы переключились на PALM-визуализацию tdEos-тубулина. Одиночные молекулы были активированы в флуорофоры, излучающие оранжевый цвет, путем низкоинтенсивного фотопреобразования с помощью лазерного света с длиной волны 405 нм, обнаружены и обесцвечены при интенсивном освещении 561 нм (2 кВт / см ² ). Для анализа мы применили фильтрацию плотности соседства к данным tdEos, чтобы исключить свободный α-тубулин, который в большом количестве присутствует в цитоплазме и иммобилизован путем фиксации ( SI Text ).Этот подход позволил лучше визуализировать митотические веретена и микротрубочки (Movie S6). Были проанализированы клетки на разных стадиях клеточного цикла, и типичные примеры представлены на рис. 5. В случае клеток, переживающих телофазу, мы могли легко локализовать шпиндели, украшенные α-тубулином и tdEos, поскольку они проходят через узкую шейку, соединяющую материнская клетка и почка (рис. 5 C и D ). На этой стадии митоза веретено состоит примерно из двух-четырех микротрубочек.Дополнительные примеры дрожжевых клеток, отображаемых на разных стадиях клеточного цикла, показаны на рис. 5. Во всех наблюдаемых случаях можно было идентифицировать веретено или микротрубочку внутри клетки, заключенную в клеточную стенку. Наблюдаемые паттерны соответствуют известной ориентации веретена-микротрубочки (30) (обычные широкопольные изображения показаны для сравнения в Supporting Information и Fig. S11). Помимо митотического веретена, мы могли обнаружить цитоплазматические микротрубочки, простирающиеся от обоих концов веретена во всем осевом диапазоне (рис.5 С ). В этом конкретном примере измеренные профили волокон тубулина в нефильтрованных данных о локализации показали полумаксимальную ширину (FWHM) ~ 65 нм в латеральном направлении и ~ 108 нм в осевом направлении (рис. S12). Эти значения больше, чем заявленные значения 25 нм в исх. 26, но разница может быть связана с пониженной точностью локализации в наших измерениях и вкладом размера тега tdEos.

Двухцветные изображения MFM PALM / STORM со сверхвысоким разрешением дрожжевых клеток, содержащих α-тубулин – tdEos- и Con A – Alexa 647-меченую клеточную стенку.Красно-желтая шкала кодирует z позиций обнаружения Alexa 647, а сине-белая шкала соответствует tdEos. ( Left ) Ячейки показаны в виде xy с глубиной цвета. (Масштаб: 1 мкм.) ( Центр ) Наклонный вид показывает митотическое веретено, проходящее через шейку почки во время деления. (Длина осей: 1 мкм.) ( Справа ) Поверхностный рендеринг локализаций tdEos в сине-белом цвете. Здесь цветовой код представляет собой плотность молекул.Снимки демонстрируют почкующиеся дрожжи на разных стадиях деления клеток. (Длина шкалы и оси: 1 мкм.) ( A ) Метафазная клетка с коротким внутриядерным веретеном, не ориентированным к шейке. ( B ) Клетка входит в анафазу, когда веретено начинает проникать через отверстие шеи. ( C ) Поздняя анафаза / телофазная клетка с митотическим веретеном, проходящим через шейку почки (Movie S6). ( D ) Клетка в конце телофазы с распадающимся веретеном, распадающимся между материнской и дочерней клетками.( E ) Постмитотические клетки G1 без веретена.

Заключение

В исследовании органелл клетки трехмерная микроскопия сверхвысокого разрешения становится важным инструментом. Наши результаты показывают, что мультифокусная микроскопия в сочетании с визуализацией PALM / STORM позволяет получать объемные изображения со сверхвысоким разрешением на глубине ∼4 мкм, что намного больше, чем другие методы, и обеспечивает точность локализации ∼20 и ∼50 нм в латеральном и осевом направлениях соответственно. Поскольку точность напрямую зависит от количества обнаруженных фотонов, в будущем она, вероятно, будет улучшена за счет использования более ярких флуорофоров и более эффективных конструкций решеток.В частности, использование многофазной решетки вместо бинарной может увеличить дифракционную эффективность до девяти центральных порядков примерно на ∼90% (31). Модифицированные конструкции с дифрагированным светом, сосредоточенным в 25 центральных порядках (вместо заявленных 9 порядков), также могут увеличить глубину изображения без ущерба для точности осевой выборки. В отличие от последовательного сканирования z для получения трехмерных изображений, наш подход позволяет получать изображения соответствующих расфокусированных молекул до того, как они станут фотообесцвеченными.Улавливание максимального количества одиночных молекул на клеточном уровне является важным преимуществом, особенно когда задействованы низкие числа копий флуоресцентных белков. Проблемой для 3D-микроскопии PALM / STORM является большое количество молекул, которые необходимо локализовать для правильной реконструкции изображения, что приводит к увеличению времени сбора данных и потенциально перекрывающимся PSF. Эти трудности можно облегчить с помощью вычислительных инструментов, таких как подгонка нескольких эмиттеров (32) или сжатое зондирование (33, 34), которые позволяют локализовать одиночные молекулы при более высоких плотностях.Таким образом, мы считаем, что многофокусная микроскопия открывает новые захватывающие возможности для получения изображений сверхвысокого разрешения целых клеток в биологических науках.

Методы

Настройка.

Для получения мультифокальных изображений на пути излучения обычного широкоугольного микроскопа (Nikon Ti-Eclipse) вводятся специальные оптические элементы (рис. 2) (23). Во-первых, дифракционная решетка, сопряженная с плоскостью заднего зрачка объектива (100 ×, 1,4 N.A .; Nikon), направляет падающий свет на девять центральных порядков с эффективностью ~ 65%.Рисунок решетки искажается, чтобы внести сдвиг фокусного расстояния между порядками дифракции. Во-вторых, комбинация светящейся решетки и призмы используется для коррекции остаточной хроматической дисперсии. В-третьих, линза формирования изображения формирует изображение девяти порядков (соответствующих девяти различным плоскостям изображения) на одном детекторе EM – CCD (DU-897; Andor). Освещение для возбуждения и активации обеспечивается набором лазеров (405, 488, 514, 560 и 640 нм), управляемых акустооптическим перестраиваемым фильтром (AA Opto-Electronic) и соединенных в одномодовое волокно.Выходной свет волокна повторно коллимируется и направляется на объектив микроскопа многополосным дихроичным зеркалом (LF405 / 488/561 / 635–4 × 4M-A-000; Semrock). Область возбуждения и активации ограничена по бокам щелью, размещенной на пути возбуждения, тогда как вторая щель на пути излучения используется для ограничения отображаемой области и предотвращения перекрытия девяти плоскостей на детекторе. Мы дополнительно разместили перед камерой полосовой фильтр (FF01-607 / 36 для PALM-визуализации tdEos и FF01-670 / 30 для STORM-визуализации Alexa 647; Semrock).

Из-за длительного времени записи (обычно ≥20 мин) для получения необработанных данных для восстановления трехмерного изображения со сверхвысоким разрешением необходимо скорректировать дрейф выборки. С этой целью шарики из полистирола (диаметром 4 мкм; Dynabeads) помещали на покровное стекло рядом с клетками-мишенями и наблюдали с помощью ИК-камеры в качестве фидуциарных маркеров (рис. 2, SI Text и рис. S5– S7). Анализ положения шариков и их дифрактограмм позволил точно определить латеральные и осевые сдвиги образца с SD менее 1 нм в латеральном направлении и 5 нм в осевом направлении.Эти координаты впоследствии были использованы для корректировки дрейфа трехмерного образца.

Калибровка системы и анализ данных.

Многоцветные флуоресцентные шарики (TetraSpeck Fluorescent Microspheres Kit; T14792; Invitrogen), иммобилизованные на покровном стекле, были использованы для калибровки установки 3D-визуализации и обеспечения точной реконструкции необработанных изображений в стопку z с минимальной потерей разрешения (23). При перемещении предметного столика микроскопа с пьезоэлементом на фиксированные шаги вдоль оптической оси, шарики последовательно появляются в фокусе на различных панелях (плоскостях z ) изображения.Проекция максимальной интенсивности полученного стека показывает, что шарики появляются в фокусе на девяти панелях. После определения центра гранул с помощью гауссовой аппроксимации вычисляется матрица преобразования для повторного выравнивания различных панелей с точностью порядка 2 нм (стандартное отклонение).

Кроме того, бинарная фазовая решетка, используемая в нашем MFM, дифрагирует около 65% падающего света в девяти (3 × 3) центральных порядках на расчетной длине волны. Относительные флуктуации между интенсивностями составляют порядка ~ 5% при проектной длине волны решетки (515 нм) и увеличиваются до ~ 50% при длине волны 670 нм, в основном из-за более яркого (0, 0) порядка.Поэтому для обеспечения правильной реконструкции объема изображения и достижения точной оценки осевого положения отдельных молекул применяется коррекция интенсивности после получения различных панелей.

Таким образом, необработанные изображения (пример показан в Movie S1) обрабатываются следующим образом. Сначала вычитается смещение камеры. Во-вторых, панели изображений разделяются и выравниваются с использованием матрицы преобразования, созданной на этапе калибровки шариков. В-третьих, корректируются относительные интенсивности различных панелей; Трехмерная гауссовская аппроксимация отдельных трехмерных PSF была выполнена с помощью свободно доступного программного обеспечения FishQUANT (35) для определения положения эмиттера, а трехмерные изображения со сверхвысоким разрешением визуализировались с помощью программного обеспечения ViSP (29).

Двухцветная колокализация и

Калибровка выполняется перемещением разноцветных флуоресцентных шариков, установленных на покровном стекле, вдоль оптической оси при последовательной записи изображений в двух спектральных каналах в каждой позиции. Проекционное изображение максимальной интенсивности каждого канала было реконструировано, и шарики были локализованы на разных панелях изображения в разных каналах.

Затем положение гранул на каждой панели изображений сравнивалось с центральной (неискаженной) панелью красного канала.Относительные положения служили основой для двух калибровочных матриц, которые позволяли точно реконструировать трехмерный объем, а также точно совмещать плоскости двух каналов с учетом любого возможного увеличения, поворота или трансформации.

Любое смещение номинальной плоскости между двумя каналами также определялось и учитывалось на этапе постобработки, а также расстояние между плоскостями как функция длины волны изображения ( SI Text и рис.S3).

Общая точность спектральной регистрации составляет 10 нм в поперечном измерении и 30 нм в осевом направлении. Точность была определена экспериментально, когда разноцветные бусины отображались последовательно в двух каналах (рис. S4).

Благодарности

Мы благодарим покойного Матса Густаффсона за оригинальный дизайн многофокусного микроскопа; Саре Абрахамссон за помощь в разработке и изготовлении микроскопа; Флориану Мюллеру за помощь с программным обеспечением для локализации; Глебу Штенгелю, Давиде Норманно и Игнасио Изеддину за полезные обсуждения; членам Консорциума по визуализации транскрипции (TIC) Медицинского института Говарда Хьюза Джанелия Фарм за их помощь и обсуждение; ДокторКарин Буш для плазмиды TOM20-GFP; Люку Лавису и Джонатану Б. Гримму за обмен красителями и полезные обсуждения; отдел информационных технологий (ИТ) исследовательского центра Janelia Farm Research Campus для настройки конвейера кластерного анализа и помощи с программным обеспечением; и Василию Гурченкову за его вклад в создание фигур и графического изображения. B.H. благодарит TIC, Фонд Пьера Жиля де Женна и Агентство по изучению рака (Фонд ARC) за финансовую поддержку. Мы благодарим за финансовую поддержку программы Paris-Science-Lettres Французского национального исследовательского агентства (ANR) (ANR-10- IDEX-0001-02 PSL), Labex CelTisPhyBio (N ° ANR-10-LBX-0038), поддерживаемой инфраструктуры France-BioImaging. от ANR Grant ANR-10-INSB-04 (Инвестиции в будущее) и ANR Grant TRIDIMIC.

Сноски

• Вклад авторов: B.H., C.W. и M.D. разработали исследование; B.H., J.W. и J.C. провели исследования; B.H., M.E.B. и A.R. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; B.H. проанализированные данные; B.H. и доктор медицины написал статью; B.H. спроектировал и смонтировал установку микроскопа и разработал трубопровод; и Дж. и C.W. предложили и сконструировали штамм дрожжей.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• ↵ * Для этой статьи с прямым представлением был назначен редактор.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1412396111/-/DCSupplemental.

Датчики шариков полиакриламида для количественной оценки стресса в масштабе клеток in vivo при развитии рыбок данио