Ежик из газетных трубочек: Урок плетения из газет «Ежик»

Содержание

ежик и совенок. Сова из газетных трубочек

Плетение из газетных трубочек: мастер-класс для начинающих

Поделки своими руками из газетных трубочек — отличная возможность разнообразить летний отдых с детьми. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. О том, как заготовить трубочки, мы рассказали в прошлый раз. Сегодня предлагаем первый урок плетения — мастер-класс по изготовлению из газетных трубочек фигурок лесных обитателей.

Ежик

Вам потребуются:

8 трубочек длиной 30 см (4 темные и 4 светлые)

  1. Начнем работу светлыми трубочками. Сложите одну из них в форме капли и склейте концы. Получилась заготовка для туловища и мордочки. Вторую трубочку положите сверху, ее кончик станет хвостиком ежика.
  1. Длинным концом второй трубочки начните оплетать туловище восьмеркой. Загните трубочку назад, обведите вокруг основы с одной стороны хвостика, пропустите через середину туловища, обведите вокруг основы с другой стороны хвостика и т.д. Во время плетения старайтесь, чтобы туловище ежика сохраняло форму капли.
  1. Завершите работу, оставив мордочку неоплетенной. Закрепите рабочую трубочку и отрежьте лишнюю часть.
  1. Чтобы сделать нос, оберните кончик мордочки отрезком темной трубочки, приклейте его и зафиксируйте прищепкой. Сверните спиралью еще один отрезок — получится глаз. Закрепите его в месте окончания оплетки. Между витками вклейте сложенные пополам короткие трубочки-ножки.
  1. Так же, как ножки, сделайте ежику иголки. Концы трубочек при этом срежьте наискосок.

Совенок

Вам потребуются:

7 трубочек длиной 30 см (5 темных и 2 светлые)

  1. Две чуть влажные светлые трубочки сплющите, скрутите в спирали, подклейте и дайте заготовкам высохнуть. Получились глаза совенка.
  1. Над глазами положите темную трубочку, согнув ее дугой. Концы второй темной трубочки подклейте к середине и поместите ее над первой, также согнув.
  1. Снизу положите третью трубочку, как показано на фото. Она будет рабочей.
  1. Начните оплетать туловище совенка способом «пеленание», пропуская через середину заготовки то левый, то правый конец рабочей трубочки.
  1. Выполнив два ряда, отведите петельки-крылья в стороны и продолжайте плетение на боковых трубочках.
  1. Когда туловище достигнет желаемой длины, подклейте рабочие концы с обратной стороны. Боковые трубочки-лапки срежьте наискосок. Из обрезков сделайте клювик и ушки-кисточки. Закрепите их на голове совенка.

Авторская статья

Статья предоставлена издательством «АСТ-Пресс»

https://www.7ya.ru/Bauskas iela 58A — 7RīgaLV-1004

Оцените статью

Читайте также

Симпатичные звери получились. Если бы просто увидела фото без названия статьи — ни за чтоб не догадалась из чего они сделаны

2015-06-24, Светик_Ив

Всего 1 отзыв Прочитать все отзывы.

05.06.2015

Обновлено 25.02.2020

Вторая жизнь старых газет и журналов

Автор: Феонова Евгения Владимировна, воспитатель первой квалификационной категории.
Идея 1 Поделки из газетных трубочек.
Для изготовления трубочек понадобятся: старые газеты; тонкая спица или деревянная палочка; клей; ножницы; линейка.
1. Разрезаем газету на полоски шириной по 9 сантиметров.
2. Спицу или палочку укладываем на угол газетной полоски под углом от 45 до 60 градусов и наматываем газету на спицу. От величины угла зависит плотность будущей газетной трубочки. Если нужны более плотные трубочки, которые можно использовать для основы изделия, то угол должен быть 45 градусов. Если нужны трубочки более гибкие для оформления изделия, то спицу укладываем на бумагу под углом 60 градусов.
В конце наматывания на оставшийся угол капаем клей и приклеиваем край. Так трубочка не будет раскручиваться. Вынимаем палочку из трубочки.
Из газетных трубочек можно изготавливать предметы интерьера, декоративные украшения и детские игрушки.
ЕЖИК
Для ежика необходимо подготовить: 8 трубочек и клей.
1. Первую трубочку складываем в форме капли и склеиваем концы. Получается заготовка — туловище и мордочка. Вторую трубочку кладем сверху так, чтобы ее кончик стал хвостом.
2. Длинным концом второй трубочки оплетаем туловище восьмеркой: загибаем ее назад, обводим вокруг основы с одной стороны хвоста, пропускаем через середину туловища, обводим вокруг основы с другой стороны хвоста и т.д. Во время работы необходимо следить, чтобы туловище сохраняло форму капли.
3. Мордочку ежика оставляем неоплетенной. Закрепляем конец трубочки клеем.
4. Кончик мордочки оборачиваем кусочком темной трубочки так, чтобы получился нос, и закрепляем клеем. Для глаза сворачиваем небольшой отрезок трубочки спиралью и приклеиваем. Из коротких трубочек сложенных пополам делаем ножки ежу, продевая их между витками.         
Идея 2 Бусы из журналов
Понадобятся: разноцветные страницы журналов, вазочка для сбора готовых бусин, тонкая спица или деревянная палочка и канцелярский клей ПВА.
1. Нарезать надо сразу много заготовок в виде длинных треугольников
2. Начиная с основания, бумажную полоску нужно наворачивать на край спицы, пока не останется трехсантиметровый хвостик.
3. Теперь, обмакнув большой палец в клей, прогладить полученный кокон, обильно смазывая его по всей длине накрутки. Высыхает клей на воздухе очень быстро, не затягивая финишный момент создания бусины. Она высыхает прямо в руках, поэтому ее можно практически сразу положить в приготовленную вазочку.
4. Когда все полоски будут скручены, и бусины складывать будет уже некуда, останется собрать их на нитку. Можно вместо нитки взять тонкую шляпную резинку.
   
Идея 3 Коллаж
Коллаж (от французского collage — приклеивание) технический приём в изобразительном искусстве, заключающийся в создании живописных или графических произведений путём наклеивания на какую-либо основу предметов и материалов, отличающихся от основы по цвету и фактуре.
Понадобиться: лист бумаги, клей карандаш, ножницы и карандаши (фломастеры, краски и кисти) для наброска.
1. Для начала вам нужен набросок рисунка (полки в магазине , дороги в городе )
2. Соберите журналы и вырвите из них все заслуживающие внимания страницы.
3. Журнальные страницы можно резать, а можно и рвать. Рваный край отлично выглядит в пейзажных коллажах-зарисовках.
4. Приклейте к листу с набросками.

Ёжики-корзинки из газет своими руками. Мастер-класс с пошаговым фото / Мастерклассы Блоги

Отличным украшением осеннего декора может послужить корзинка-ежик. Предлагаю вам сплести ежика из газетных трубочек. Подготовила для наглядности и вашего вдохновения подборку работ чешских мастериц. Особенно хочу отметить работу мастерицы Finecigars (фото ниже). В ежике-корзинке фрукты, которые тоже сплетены из газетных трубочек. Нашла подходящий мастер-класс по плетению дна корзинки, которое можно сплести разными способами и разной формы. Вобщем, смотрите, вдохновляйтесь и удачи вам в творчестве!


Такой топиарий из газет для украшения осеннего интерьера вы легко сможете сплести, если используете в качестве формы для оплетания шарик или резиновый мячик. Ствол топиария — толстая веточка дерева

Как сплести дно для ежика-корзинки

Для удобства плетения возьмите картонку и нарисуйте на ней круг с диагоналями

Начинаем плести с 8-ми трубочек

Используйте в работе прищепки, так плетенка получится ровной и аккуратной

Начинаем плести первый ряд. Берем дополнительную трубочку

Захватываем сразу по 4 трубочки

Второй ряд: добавляем трубочку и оплетаем по 2 трубочки предыдущего ряда

Четвертый ряд: плетем косичкой, захватывая по одной трубочке предыдущего ряда

Плетем до получения нужного размера дна корзинки

Точно так же можно сплести дно с использованием большего количества трубочек. Особого значения это не имеет, дно можно сделать и из картона.

Когда дно готово, берем подходящую форму для оплетания — миску, чашку, все, что угодно

Край корзинки можно сделать неровным, он может быть выше с одной стороны. Для этого плавно переходить на плетение рядов, оставляя по нескольку трубочек без оплетания

Для носика ежика желательно оплетать подходящую форму и использовать в работе проволоку

Начинать работу с 4-х длинных трубочек, согнутых пополам

Для изготовления иголок трубочки покрасить до работы, оставив серединки незакрашенными

Для колючек нарезать газету на прямоугольники 12 на 11 см

Для колючек можно скрутить трубочки из кассовой ленты

Вот так располагаем колючки. Сделать это можно, как после, так и в процессе плетения корзинки

Вплетаем носик

Трубочки с внутренней стороны прячем и подклеиваем

 

Можно сплести не корзинку, а ежика. Будет он выглядеть вот так:

Для колючек можно использовать не газетные трубочки, а веточки

Если вы являетесь автором фотографии, использованной в статье, напишите нам, мы обязательно укажем авторство!

Мастер-класс по плетению из газет: Корзинка Ёжик

Автор: Татьяна Порошкова

Блог автора

Здравствуйте, дорогие Мастерицы!

Вот такой ежик, приносящий клубочки теперь живет у меня

на плетение меня вдохновил вот этот веселый ежик с чешского сайта

а начинала плести так, по 4 трубочки соединила крест накрест.
Трубочки красила водной морилкой «Красное дерево»

затем «веревочкой» 2 ряда оплетала 4 трубочки

дальше трубочки разделила и 6 рядов оплетала 2 трубочки

потом 5 рядов оплетала каждую трубочку, получилось такое «солнышко»

для завершения низа каждую стоечку заводила за соседнюю и поднимала вверх

вот такое донышко получилось

дальше плела 4 ряда » веревочкой немного расширяя. На этом этапе конструкцию покрыла лаком, чтобы она не «ездила » в разные стороны и была жесткой

далее приступила к иголкам, трубочки сделала коротенькие

заводила за стоечку иголки и сверху прижимала рядом «веревочки», иголки располагала в шахматном порядке (через одну стоечку)

получилось вот так, обязательно надо оставить пустое место для носика

потом сплела 15 рядов немного сужая кверху, получилась чашка с иголками.
Закончила так: стоечки заводила одну за одну и кончик прятала. Но так как эта работа мой долгострой незаконченная простояла около 3 месяцев, стоечки пересохли и при загибании просто лопались и рвались.
Расстроившись я расплела эту загибку. Стоечки обрезала «под корень»

сплела косичку и просто приклеила ее на клей «Момент»

для носика подклеила несколько трубочек на пустующее место, предварительно наметив овал и стала их оплетать

плела сильно сужая к носику, лишние стоечки, которые стали мешать просто спрятала внутрь «мордочки»

приклеила глазки

вот и готов мой длинноносик. Мордочку надо было покороче сделать. Ну, что же, я рада, что вообще его закончила, а то декупаж не дает больше ничего делать.

пока ежик приносит клубочки, потом думаю будет и яблочками баловать

хороший друг моему слонику

Вспомнила о засушенном букете из кленовых листьев, по-моему неплохо смотрится


Плетение из газетных трубочек — Своими руками, детские, поделки, фото, дача, дом, сад

Предлагаем вам урок по плетению из газет ежика! Мы надеемся, что вам понравится этот замечательный ежик!

Для урока плетения из газет приготовим:

— газетные трубочки
— кассовая лента (или другая тонкая бумага)
— краска двух цветов: темно-коричневого и светло-коричневого
— проволока
— глазки от игрушек
— клей ПВА

Начинаем урок плетения из газет «Ежик»

Возьмем 4 б … Читать дальше »


Представляем вам урок по созданию дракона из газет. Уверены, что среди наших читателей найдутся желающие создать такого замечательного дракончика!

Для дракона из газет приготовим:

— круглая палка (форма для создания шеи)
— газетные трубочки
— зеленая акриловая краска
— гофрированный картон
— элементы декора (глаза, крылья)
— зубочистки
— клей ПВА

Начинаем урок по пле … Читать дальше »


Сегодня мы расскажем вам, как сплести замечательную курочку из газет. Уверены, что она сможет украсить собой ваш дом, а так же стать замечательным подарком для близких и друзей.

Для создания птицы из газет возьмите:

1. Бумагу или газеты
2. Клей
3. Спицу
4. Элементы декорации (глазки-бусинки, ленточка для гребешка и пр.)

Начинаем плести птицу из газет с плетения круглой корзинки. Д … Читать дальше »


Это симпатичное сердечко сможет сплести каждый. Для этой поделки из газетных трубочек приготовим:

— газетные трубочки
— плоскогубцы
— бокорезы
— проволока
— клей

Начинаем создание интересной поделки из газетных трубочек

С помощью плоскогубцев придадим проволоку форму сердечек. Бокорезами отрежем лишнюю проволоку

Сделаем достаточное количество газетных трубочек
… Читать дальше »


Сегодня предлагаем вам окунуться в мир творчества и красоты и создать вместе с нами салфетницу своими руками. Мы уверены, что такая красивая подставка для салфеток станет прекрасным дополнением праздничного стола.

Для работы над подставкой для салфеток нам необходимо приготовить:

1. газеты;
2. ножницы;
3. клей ПВА;
4. акриловые краски;
5. кисточки;
6. проволока;
7. элементы декор … Читать дальше »


В этом уроке мы с вами сплетем рамку для фотографий. Принцип плетения довольно прост, однако для отличного результата следует учесть некоторые моменты.

Для изготовления рамки из газет приготовим:

— картон
— газеты
— клей
— спицу
— прищепки
— линейка
— ручка
рамка из газет
Начинаем плетение рамки из газет

Начнем с изготовления бумажных трубочек. Для этог … Читать дальше »


Предлагаем создать на Новый год снежинки из бумаги (газет, книг или красочных журналов), можно также использовать и цветную бумагу. Такие снежинки из бумаги не сложно создать самостоятельно и можно также приобщить детей.

Для создания снежинок потребуется:

— 21 полоска плотной цветной бумаги (одинаковой ширины и длины)
— несколько прищепок

— клей ПВА

— декор по желанию (мишура, блестки, кр … Читать дальше »


Плетеными изделиями из газет и журналов можно украсить не только свой дом, но и сад. Сегодня для украшения садового участка предлагаем вам сплести кормушку для птиц.

Для плетения из газет и журналов кормушки приготовим:

— пластиковую упаковку из под CD-дисков
— трубочки
— сверло
— клей
— ножовка
— проволока
— шуруп и гайка
— бокорезы
— резинка
— картон
… Читать дальше »


Сундучок для рукодельницы. Мастер-класс!…

В январе этого года я писала в дневнике о своем очень нужном для нас, рукодельниц, предмете.

Но так как никто не полезет в мой дневник за тридевять земель, я решила выложить тот МК и здесь. Надеюсь вам, мои дорогие девочки, пригодится!

Давно о сундучке для рукоделия мечтала, но цены такие кусачие (сундучок, какой хотела я, стоит 1900 руб!!!), вот и пришлось мне сам … Читать дальше »


Мы с вами успели сплести множество поделок, но вот до ботинок из газет так и не добрались. Предлагаем исправить это безобразие и вместе сплести обувь из газеты! Готовы? Тогда начинаем урок!

Для ботинок из газет приготовим:

— картон (будем вырезать форму)
— газетные трубочки
— прищепки
— клей

Теперь мы можем начать урок по плетению ботинок из газет

Для начала возьмем картон и … Читать дальше »


КАК Я КРАШУ ТРУБОЧКИ ДЛЯ ПЛЕТЕНИЯ ИЗ БУМАГИ…

Все кто плетут изделия из бумаги уже давным-давно знают как это делается…., но мне сегодня захотелось показать Вам как это делаю я, может кому и пригодится… а нет так нет….

Так вот, я нашла бутылку (именно бутылку, т.к. емкость должна быть высокой, ну хотя бы половина высоты трубочек)
Второе важное условие — ГОРЛЫШКО бутылки должно быть ШИРОКОЕ !!!!.
День … Читать дальше »


Делаем корзинку или чашу из газеты

Такие корзинки могут украсить вашу кухню, загородных домик и послужить еще и по скоему назначению.

В них можно класть какие-нибудь мелкие вещи или даже собирать ягоды и ставить на стол. Также Корзинки можете сделать своим детям вместе с ними, тем самым прививая им навыки рукоделия.

Для изготовления нам понадобится:

— газета, листы журналов или цветная бумага. ч … Читать дальше »


Сундучок для швейных принадлежностей

Сегодня закончила делать сундучок для швейных принадлежностей!

Давно о подобном мечтала, но цены такие кусачие (сундучок, какой хотела я, стоит 1900 руб!!!), вот и пришлось мне самой поизголяться!
Мастер-класс, : Сундучок для швейных принадлежностей Бумага газетная.

Порылась в инете, нашла более-менее подходящие для меня идеи, и вперед, за работу!!!

Д … Читать дальше »


Поскольку выполняю много работ связанных с краской, возник вопрос где же её хранить. Взяла коробку из под бокалав для мартини, и решила сотворить с ней что нибудь. Накрутила трубочек из листов старого журнала ( ушло 2 журнала). С помощью клеевого пистолета приклеила по периметру коробки. На крышку мне Настёнка нарвала куски газеты, смяла и я их приклеила на клей ПВА, украсила все теми же трубочками. Покрасила, покрыла лаком и уже не коробка, а су … Читать дальше »

Каждый раз, когда я видела плетеные сердца из лозы или из веток в магазине, появлялось большое желание купить. Очень они мне нравятся, смотрятся очень красиво. Но слова моего мужа — «Такое можно и самим сделать! » всегда меня останавливали. И эта история повторялась не один раз…Я уже знала, где сердце будет висеть и как оно будет смотреться. Только одного не хватало- САМОГО СЕРДЦА!
Каждый раз, когда я видела плетеные сердца из лозы или и … Читать дальше »

Газетные трубочки.

Способ изготовления

Это так называемое витое плетение.
Я предлагаю описание на примере 5-ти трубочек. Как правило такое плетение используют для работы с соломой.
Возьмите 5 газетных трубочек. Свяжите их в пучок, распределив их следующим образом: трубочки 1 и 2 находятся вместе, трубочки 3, 4, 5 находятся на расстоянии четверти круга друг от друга. Все трубочки разведите в одной пло … Читать дальше »


Способ плетения из газет

Трубочки из газет или журналов;
Клей ПВА.

Способ изготовления

Плету круглое дно до размеров выбранной формы. В моем случае это бутылка с растительным маслом 5л. Всегда стараюсь оплетать форму чем то утяжеленную. Тогда плетение не будет двигаться и плести очень удобно.
На круглое дно ставлю форму и начинаю плести вверх. Плести вверх ставиться намного легче. Только … Читать дальше »


Оказывается, плести корзинки можно не только из лозы, а из чего угодно – из ткани, ниток и даже из бумаги!
Особенно интересно плетение из газет. Внешне изделия ничем не уступают плетенкам из лозы. И для домашнего использования они довольно прочны.
И для прочитанных газет, которые выбросить жалко и девать некуда, плетение – довольно удачное применение.
Используя при плетении различные лаки, краски и пропитки для покрытия, можн … Читать дальше »

Шкатулка для рукоделия

Это работа Физалии. Мне очень нравятся ее коробочки. Плетите на здоровье!

Давно вынашивала мысль сделать многоугольную шкатулку, но коробки подходящей формы не было. Тогда взяла обычную коробку и отрезала у нее углы.

Ура, смоделировала коробку нужной мне формы!

Процесс плетения. Не везде приклеила вертикальные трубочки. Мне кажется, так интереснее. Остальное- все как обычн … Читать дальше »


Подставка для бутылки из газетных трубочек. Подставка для журналов и газет Плести подставку под горячее из газетных трубочек

Из газетных трубочек можно смастерить множество предметов: вазы, горшки для цветов, корзинки, шкатулки, дамские сумочки, и даже предметы мебели.

Работать с этим материалом не сложно, сами по себе трубочки из газет удобные для работы. Они гибкие, поэтому не ломаются. Легко соединяются между собой, а чтобы придать красивого внешнего вида, нужно покрасить краской.

Красить трубочки можно заранее. Для этого краску разводят водой, помещают трубочки до половины, потом переворачивают другой стороной. Подходит краска Морилка для дерева, есть много видов оттенков. Когда трубочки высохнут, можно приступать к работе. Покрасить можно и после сборки работы, пользуясь разными размерами кисти.

Поделки из трубочек своими руками

Такой вид творчества стал очень популярным. Он не требует никаких материальных затрат, старые газеты и журналы есть в каждом доме, их всегда выбрасывают, а можно вместо этого сотворить настоящие шедевры.

Перед работой, следует запастись их достаточным количеством. Можно взять, кроме газет и журналов, старые тетради или тонкие листы А4 плохого качества.


Изготовление трубочек

Для создания трубочек каждая страница газеты разрезается вдоль на четыре равные части. Заранее следует подготовить длинную вязальную спицу, приложить её под углом к кончику газеты. Придерживая за свободный кончик, газету намотать на спицу, после закручивания вынуть её из трубочки, склеить кончик клеем. При работе хорошо придерживать и плотно наматывать, чтобы трубочки не размотались.

Удобнее будет работать, если изготовить трубочки, в которых разные по диаметру кончики легко будет вставить одну трубочку в другую.

В интернете найдется много фото подделок из трубочек, например корзины, стаканчики, предметы мебели, фрукты, звери, по которым можно учиться.

Чтобы работа была эстетичной на вид, нужно тренироваться.

Работу с поделками из трубочек для начинающих можно начать из плетения круглых шкатулок или корзинок.


Корзина, пошаговая инструкция

Начинать нужно с основания. Склеить заранее заготовленные четыре пары длинных трубочек в форме паутины.

Начинаем плетение, чтобы зафиксировать, кончики первой трубочки склеиваем вместе. Делая дно, через каждые два кола, кончики трубочек склеиваем для прочности. Для первого раза, можно упростить работу, вырезать дно из картона и приклеить на него трубочки.

Начиная плести боковые стенки, внутрь поместить сосуд, который подходит по диаметру к корзине, это облегчит работу. Когда корзина достигла желаемой высоты, загнуть кончики, сформировать красивый ободок.

Процесс изготовления происходит методом горизонтального плетения на вертикальные трубочки, которые выходят от основания.

Ваза

Легкая в изготовлении ваза для цветов, для которой понадобится картонная основа от рулона бумажных полотенец, для придания формы вазе.

Изготовление:

Подготовить достаточное количество трубочек из газет. Нанести на картонное основание клей ПВА и приклеить трубочки вертикально, учесть, что трубочки должны быть длиннее, и полностью закрывать картон.

Верх подрезать ровно, или придать другую оригинальную форму. Когда клей полностью высох, покрыть лаком, используя кисть.

Когда навыки работы будут более отточенные, можно приступать к изготовлению поделок не правильных форм. Можно смастерить даже предметы мебели. Чтобы они были прочные, их покрывают лаком.

Мастер-класс поделки из трубочек «Стульчик»

Подготовить:

  • Пластиковый стул, для опоры.
  • Картон.
  • Трубочки из газеты.
  • Клей.

Схема плетения:

Картон поместить под кресло, обрезать до нужного размера, это послужит дном будущего стула. На картонную основу приклеить трубочки довольно плотно, на изгибе клеить под небольшим углом.

Трубочки поднять к верху. Несколькими трубочками закрепить опору, а их кончики спрятать в середину. Для работы, как дополнительные средства, используют прищепки, нити.

Когда доплетете четвертый ряд, можно применять уже по две трубочки одновременно. Соответственно, дно и стойка стульчика готовые. Дальше плетём сидение, используется только одна трубочка.

Спинка стула плетется с левой стороны, понемногу к верху сужается. Лишние кончики обрезаются и прячутся в середину. Для стула можно приделать подлокотники. Обязательно покрыть лаком, для прочности кресла.

Отточив свое мастерство, и научившись хорошо справляться этим видом материала, можно создавать необычные и оригинальные вещи.


Фото поделок из газетных трубочек

Выберите рубрику HAND MADE (322) hand-made для дачи (18) HANDMADE для дома (57) Мыло своими руками (8) Поделки своими руками (46) Handmade из бросового материала (30) Handmade из бумаги и картона (60) Handmade из природных материалов (25) Бисероплетение. Handmade из бисера (9) Вышивка (111) Вышивка гладью, лентами, бисером (43) Вышивка крестом. Схемы (68) Роспись предметов (12) Handmade к праздникам (217) 8 марта. Подарки HANDMADE (16) Handmade к празднику ПАСХA (42) День Святого Валентина — handmade (26) Новогодние игрушки и поделки (57) Открытки ручной работы (10) Подарки HANDMADE (50) Праздничная сервировка стола (16) ВЯЗАНИЕ (823) Вязание для детей (78) Вязание игрушек (149) Вязание крючком (255) Вязаная крючком одежда. Схемы и описание (44) Вязание крючком. Мелочи и поделки (64) Вязание пледов, покрывал и подушек (65) Салфетки, скатерти и коврики крючком (82) Вязание спицами (36) Вязание сумок и корзинок (58) Вязание. Шапки, шляпы и шарфы (11) Журналы со схемами. Вязание (70) Куколки Амигуруми (57) Украшения и аксессуары (30) Цветы крючком и спицами (78) Домашний очаг (548) Дети — цветы жизни (73) Дизайн интерьера (60) Дом и семья (54) Домоводство (71) Отдых и развлечения (82) Полезные услуги и сайты (96) Ремонт, строительство своими руками (25) Сад и дача (22) Шопинг. Интернет-магазины (65) Красота и Здоровье (222) Движение и спорт (16) Здоровое питание (22) Мода и стиль (81) Рецепты красоты (55) Сам себе лекарь (47) КУХНЯ (99) Вкусные рецепты (28) Кондитерское искусство из марципана и сахарной мастики (27) Кулинария. Сладкая и красивая кухня (44) МАСТЕР-КЛАССЫ (239) Handmade из фетра и войлока (24) Аксессуары, украшения своими руками (39) Декорирование предметов (16) ДЕКУПАЖ (15) Игрушки и куклы своими руками (22) Лепка (38) Плетение из газет и журналов (51) Цветы и поделки из капрона (15) Цветы из ткани (19) Разное (49) Полезные советы (31) Путешествия и отдых (18) ШИТЬЕ (164) Игрушки из носков и перчаток (21) ИГРУШКИ, КУКЛЫ (46) Пэчворк, лоскутное шитье (16) Шитье для детей (18) Шитье для уюта в доме (22) Шитье одежды (14) Шитье сумок, косметичек, кошельков (27)

Эта подставка под бутылку вина станет отличным дополнением на праздничном столе. Она очень легка и проста в своем изготовлении. И будет хорошо гармонировать с вашим интерьером.

Для работы нам понадобится:
— газета.
— шпажка.
— ножницы.
— бумага.
— гуашь или акварельные краски.
— универсальный клей «Титан».
— кисточка для окраски.

Приступаем к работе. Берем газету и нарезаем ее на полоски размером в 10х40 см. Этой длины хватит для нашей трубочки.

Берем шпажку и начинаем аккуратно накручивать газету на нее. Скручиваем плотно и не спеша. Не забываем придерживать края газеты и шпажки.

Когда мы скрутили всю трубочку, то для того, чтобы она не раскрутилась, приклеиваем конец газеты к трубочке.

Подготавливаем сразу большое количество трубочек.

Из бумаги вырезаем основание для подставки. Берем квадрат 28х28 см, две стороны, нижняя и правая, останутся также двадцать восемь см. С левой стороны отмеряем 14 см. И отрезаем от правого основания к левой отмеченной точке. Срез должен получиться 31 см. Это и будет основа для подставки под вино.

По одной начинаем приклеивать трубочки к основе. Даем клею хорошо высохнуть.

Ну вот наша основа готова.

Вырезаем из плотного картона круг диаметром 9,5 см. Это будет дно для подставки. Со стороны, которая будет находиться внутри подставки, приклеиваем обычную белую бумагу. Соединяем и склеиваем основание подставки. Вставляем и приклеиваем дно к нижнему росному краю.

Когда клей высохнет, начинаем декорировать подставку. Для этого возьмем трубочку. Сжимаем трубочку, чтобы она стала плоская. И начинаем приклеивать с верхней части. Обклеивая только по краю.

Начинаем окрашивание подставки. У нас будет 2 цвета для окрашивания, это белый и коричневый. Первый слой будет белый. Прокрашиваем все, чтобы не было видно буквы на газете. Когда краска высохла, и не осталось и следа от напоминания о газетах, мы приступаем к следующей покраске. Берем коричневую краску и снова все окрашиваем. Ждем высыхания краски. Той же краской окрашиваем внутренние стенки подставки.

Когда краска внутри подсохнет, то наша подставка под бутылку вина будет готова.

– это новый вид рукоделия, освоив который вы сможете создавать настоящие шедевры. Современные мастерицы плетут не только корзинки из бумаги, но и красивых зверей, корабли с парусами, домики для кукол и даже кормушки для птиц. Новичкам советуем сначала освоить технику скручивания самих трубочек, а потом попробовать сделать подставку для тетрадей из газет .

Как делать газетные трубочки

Для подготовки трубочек подходит абсолютно разная бумага. Идеальный вариант – чистая офисная, так как она не токсичная и ее намного проще перекрасить в любой другой цвет. Для работы вам понадобится спица, ножницы и клей. Разрежьте лист бумаги на полоски шириной от 7 до 13 см. Чем длиннее будет трубочка, тем лучше, иначе вам придется ее постоянно наращивать. При этом помните, что слишком длинные полоски тоже тяжело закручивать.

Смотрите видео: Как крутить трубочки из газет

Теперь возьмите спицу и начните наматывать на нее полоску бумаги с нижнего уголка. Таким способом вам нужно полностью накрутить бумагу на спицу. Не забудьте зафиксировать край клеем и вытянуть спицу. Можете сразу же покрасить трубочки. Хранить из лучше всего в вертикальном положении, чтобы они не помялись до того времени, когда вы приступите к изготовлению поделки.

Мастер-класс: Подставка под карандаши или тетради

Сделайте достаточное количество трубочек из офисной бумаги или газет. Наметьте ручкой на картонном дне место для расположения трубочек-стоек. Это важно сделать под линейку, чтобы готова поделка была красивой. Чтобы облегчить приклеивание, возьмите двусторонний скотч и наклейте его на дно. Потом по разметке прикладывайте подготовленные трубочки. Сверху нанесите клей-пва и приклейте вторую часть основания. В результате у вас будет красивая заготовка для дна подставки и по 4 трубочки-стойки с узкой стороны, а с широкой – по 9 трубочек для плетения.

Заготовка должна хорошо просохнуть, а потом можете приступить к дальнейшему плетению. Для красоты основание можете оплести красивым шнурком или тесьмой подходящего цвета. Или возьмите газетную трубочку и оплетите дно простым способом. Теперь поднимите все стойки наверх. Для этого трубочку заводите под две соседние и поднимайте. При помощи спицы вы сможете поднять и закрепить две оставшиеся трубочки.

Потом снова возьмите две газетные трубочки и оплетайте стойки веревочкой. Таким методом вам нужно будет оплести около 9 рядов, а потом изменить угол наклона для того чтобы сделать ажурный элемент.

Готовая подставка из трубочек

Также смотрите :

Корзинка и корабль

На первый взгляд, может показаться сложным изготовление корзинок или подставок из газетных трубочек. Но если вы наловчитесь правильно и аккуратно их переплетать, то уже первая поделка у вас будет достаточно красивой.

Плетение из газетных трубочек — очень популярное занятие, и это неудивительно: что-то должно было прийти на смену традиционному плетению из лозы. из бумаги получаются ничуть не хуже, а главное, плетение из трубочек доступно и взрослым, и детям — надо только заготовить побольше материала. Этим мы сегодня и займемся: представляем мастер-класс для начинающих по изготовлению газетных трубочек.

Материалы и инструменты

Бумага. Отправимся на заготовки «бумажной лозы»! Из чего лучше делать трубочки для плетения? Прежде всего из старых газет. Газетная бумага тонкая, хорошо скручивается, отлично впитывает краску. Также подойдет бумага формата А4 низкой плотности (60-65 г/м2). Она называется «газетная» или «потребительская», «писчая».

Кроме этого, для изготовления трубочек можно использовать журналы, старые тетради, кассовую ленту и т.д.

Как резать бумагу
Бумага — волокнистый материал, и у нее, как и у ткани, есть продольное и поперечное направление волокон. Обычно у газет малого формата (57×40 см) волокна проходят вдоль длинной стороны, а большого (84×57 см) — вдоль короткой. У бумаги формата А4 волокна чаще проходят по длинной стороне, но иногда попадается бумага, нарезанная производителями поперек. Прежде чем разрезать на полосы всю пачку, проверьте скручиваемость материала на одном из листов. Положите лист на влажную поверхность — он сам начнет сворачиваться в рулон в продольном направлении. В этом направлении и надо резать.

Клей. Для работы с газетными трубочками можно выбрать любой клей, подходящий для бумаги. Например, ПВА или клей-карандаш. Важно, чтобы он обладал хорошими фиксирующими свойствами, иначе ваши трубочки могут раскрутиться во время покраски.

Густота также имеет значение. Если клей окажется слишком жидким, трубочки будут размокать при наращивании.

Морилки для дерева на водной основе помогут покрасить бумажные трубочки в цвета древесины сосны, клена, дуба, палисандра и даже эбенового дерева. В продаже можно найти около двух десятков оттенков. Существует морилка в порошке, которая перед работой разводится водой.

Смесь строительной грунтовки и колера также очень хорошо подходит для окрашивания трубочек. Перед работой обязательно разбавьте грунтовку водой, как указано в инструкции на флаконе. Имейте в виду, что бумага относится к сильно впитывающим поверхностям.

Чем еще окрасить трубочки
Чтобы придать трубочкам желаемый цвет, можно использовать краски для шерсти, ткани, принтера, пищевые красители, горячий отвар луковой шелухи, зеленку и марганцовку.

Лак. Чтобы ваша работа получилась прочной и не боялась сырости, ее нужно покрыть лаком. Подойдет любой лак для дерева, но в помещении лучше всего использовать акриловый. Он не имеет запаха, после нанесения быстро высыхает и становится прозрачным, образуя защитную пленку.

Спицы и шпажки. Для скручивания бумажных полос в трубочки вам понадобятся спицы разных диаметров — от 1,5 до 4,5 мм — или деревянные шпажки для шашлыка. Трубочки, скрученные на тонкой спице, больше всего похожи на лозу. Они плотные и почти не сминаются во время плетения. А на толстой спице получаются трубочки, которые легко сплющить. И если они скручены из очень тонкой бумаги, то ими можно плести как соломкой.

Ножницы или нож. Один из этих инструментов понадобится вам для разрезания газет на полосы. А вот скрученные трубочки лучше всего подрезать кусачками.

Пульверизатор нужен, чтобы увлажнить пересохшие трубочки: сбрызните их водой и положите в целлофановый пакет. Они снова станут гибкими и послушными. Также пульверизатор можно применять для нанесения краски на поделку.

Кисти используются для покраски готовых поделок и — иногда — трубочек. Вам понадобятся широкая и тонкая кисти.

Прищепки фиксируют трубочки, не дают плетению распуститься и облегчают склеивание деталей.

Шилом делают отверстия, раздвигают ряды плетения, протаскивают между ними трубочки.

Изготовление газетных трубочек

  1. Разрежьте газету вдоль длинной стороны на несколько частей. Две полосы по краям самые ценные, из них получаются белые трубочки. Центральные полосы тоже пойдут в дело. Трубочки с буквами хорошо смотрятся в плетении, подчеркивают необычность материала.

  1. Крутить трубочки лучше всего на столе с шероховатой поверхностью. Приложите к одной стороне бумажной полоски спицу под углом примерно 30°. Если на спице есть ограничитель, то он должен находиться за поверхностью стола.

  1. Уголок газеты заверните под тем же углом и крепко прижмите.

  1. Правой рукой поворачивайте спицу, постепенно скручивая трубочку, левой — придерживайте газету.

  1. На уголок полоски капните немного клея, сверните ее до конца и дайте клею схватиться.

  1. Выньте спицу. Так как мы начинали скручивать полоску со стороны текста, трубочка получилась белой.

Ширина бумажных полос зависит от того, какое изделие вы задумали. Если вы решили сплести что-то крупное, то ширина полосы должна быть 8-10 см. Для маленькой поделки достаточно 6-7 см. Чем уже полоса, тем тоньше должна быть спица. Полосы шириной 10 см лучше всего накручивать на спицу диаметром 2,5 мм. Для полосы шириной 6 см подойдет спица диаметром 1,5 мм.

Наращивание трубочек

Если вы скрутили трубочку правильно, то с одной стороны она будет немного шире, чем с другой. В этом случае для наращивания одну трубочку нужно просто на 1,5-2 см вставить в другую.

Если концы трубочек получились одинаковыми, то для наращивания сложите один конец «уголком» или срежьте его под острым углом.

Чтобы соединение было крепким и надежным, используйте клей.

Окрашивание

Газетные трубочки удобно красить в лоточке с небольшим количеством жидкости или окунать в бутылку с широким горлышком сразу по несколько штук. Можно красить широкой кистью на предварительно покрытой клеенкой поверхности, слегка прокручивая трубочки. Сушить их лучше всего на решетке или сложив поленницей.

Если вы хотите покрасить готовую поделку, делайте это сначала широкой кистью, а затем тонкой, тщательно промазывая щели. Также работе можно придать желаемый цвет с помощью пульверизатора или погрузив ее в емкость с красящим средством и потихоньку поворачивая.

В следующий раз мы сплетем первые фигурки из газетных трубочек.

Комментировать статью «Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер-класс»

Отправить свой рассказ для публикации на сайте можно на

Еще по теме «Поделки из газетных трубочек»:

Поделка по технологии 2 класс «корзина с цветами»: выдали 2 листа, ребенок понял только, что это надо на картон наклеить. А дальше что делать? На одном листе овал, похожий на унитаз «вид сверху», на втором вообще какие-то 3 фигни, одна круглая, другая каплеобразная, третья…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Если бы просто увидела фото без названия статьи — ни за чтоб не догадалась из чего они сделаны.. Комментировать статью » Поделки своими руками из газетных трубочек…

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Вышивка крестиком, бисером, лентами, гладью [ссылка-28] 80. Как сделать паспарту своими руками: декорирование при помощи красок, ткани и других подручных средств.

Как всегда просят поделки. Я сначала сплела гнездо из лыка и веток. Фото есть в паспорте и здесь с инструкцией: [ссылка-1]. Я где-то в стране мастеров видела клетку из газетных трубочек.Я думаю что они еще лучше будут в клетке смотреться. 01.04.2013 15:06:47, нинуля.

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Они плотные и почти не сминаются во время плетения. А на толстой спице получаются трубочки, которые легко сплющить. И если они скручены из очень тонкой бумаги, то ими можно плести как соломкой.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер-класс. Поделки из бумаги своими руками: лопастная вертушка. Приклейте на серединку « цветка » кружок диаметром 3,5 см, вырезанный из черной бумаги.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Булгакова Светлана. Плетение из газетных трубочек для начинающих: пошаговая Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети.

Готовые поделки из пластиковых трубочек украсят интерьер комнаты. Изготовление газетных трубочек для плетения своими руками. Он не имеет запаха, после нанесения быстро высыхает и становится прозрачным, образуя защитную пленку.

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

Две недели назад Филька научился пить из трубочки -соломки, так теперь это у него культ! Вообще он может пить из чего угодно: из кружки давно, из бутылок даже пьет с узким горлышком, не проливая ни капли! Только с расплескиванием везде проблемы. А вот коробочку сока…

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Эксклюзивные модели. [ссылка-6] 7. Фенечки.ру — Плетение фенечек из мулине; кумихимо и др. [ссылка-7] 8. Авторские схемы Бабочки из пластиковых отходов (Рассказ сына). Лариса Курочкина Татьяна Щур Анна…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Советуем прочитать: сколько спят дети до года. как плести из газетных трубочек для…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Сегодня предлагаем первый урок плетения — мастер-класс по изготовлению из газетных…

Мои руки во время плетения находятся на весу, поэтому быстро устает спина. Приходится часто отдыхать. Но какое наслаждение я получаю от хрустального звона коклюшек! Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

Мои руки во время плетения находятся на весу, поэтому быстро устает спина. Приходится часто отдыхать. Но какое наслаждение я получаю от хрустального звона коклюшек! Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

интересные идеи, варианты плетения и пошаговая инструкция по созданию поделок (85 фото) Подставки из газеты своими руками

Можно сделать огромное количество поделок.

А если дом заполнен газетами и/или журналами, то еще лучше, т.к. вы еще и сэкономите на бумаге.

Из такого материала вы сможете смастерить очень красивые изделия.

Вот лишь небольшая часть того, что можно сделать из газет и журналов.

Работы из газет: настенные часы

Можно сделать это украшение без использования часового механизма — получится красивая декорация для дома, напоминающая солнце.

Вам понадобится:

Примерно 24 газетных или журнальных листов

Карандаш или ручка (чтобы удобнее закручивать трубочки)

Ножницы

Длинная иголка

Два пластмассовых диска (наподобие тех, что защищают большую упаковку CD дисков)

* диски можно заменить цветным картоном любого цвета.

Картон в форме круга с отверстием посередине (по желанию)

Часовой механизм на батарейках (по желанию)

Поделки из газет своими руками: проект «Бабочка»

Вам понадобится:

Газета или ненужный журнал

Трафарет бабочки

Двухсторонний вспененный скотч

Матовый картон

* Можно сделать бабочек нескольких размеров и форм.

* Если хотите сделать бабочку одной формы и размера, то можно использовать один трафарет или купить форменный дырокол.

1. Приготовьте трафарет.

2. С помощью трафарета нарисуйте на разных листах журнала или газеты бабочек. Можно нарисовать на одном листе бабочку, сложить вместе несколько листов и вырезать сразу несколько бабочек.

3. Вырежьте бабочек.

* Каждый лист можно разрезать на широкие полоски, которые можно сложить вместе, нарисовать на одной полоске 2-3 бабочки разного размера и вырезать несколько сразу.

4. По мере того, как вы вырезаете бумажных бабочек, аккуратно складывайте их на ровной поверхности. Можете их раскладывать в зависимости от цветовой гаммы и/или размера (формы).

5. Приклейте к каждой бабочке двухсторонний вспененный скотч. Можете немного согнуть крылья бабочкам. Также попробуйте сделать несколько слоев двойного скотча, чтобы бабочки «летали» на разных уровнях.

6. Приготовьте матовый картон. Для удобства можете карандашом наметить места, куда вы будете приклеивать ваших бумажных бабочек.

* Выбирайте подходящий фон для вашей композиции.

7. Вставьте картон в рамку. Можно из рамки вытащить стекло, если мешает.

Браслет из газет (мастер-класс)

Вам понадобится:

Газеты или журналы

Ножницы

1. Вырежьте прямоугольники размером 10 см х 4 см.

2. Каждый прямоугольник согните вполовину по длине и разогните.

3. Слева и справа согните концы к линии сгиба.

4. Снова сложите вполовину, чтобы сделать длинную тонкую полоску.

5. Сложите полоску вполовину по ширине и разогните ее.

6. Согните левую и правую половинки вполовину, чтобы они встретились у линии сгиба.

7. Снова сложите фигуру пополам, чтобы получилась буква V.

* Подобным способом нужно сложить несколько прямоугольников.

8. Чтобы начать складывать браслет, нужно соединить все детали. Начните ушки одной фигуры вкладывать в ушки другой, пока в цепи у вас не будет 27 звеньев. Всего нужно 3 цепи.

9. Соедините цепи с помощью нескольких заготовок (формы V).

Как сделать цепь из бумаги:

Поделки из газет для начинающих: ваза и подставка из газет

Вам понадобится:

Клей или клей-карандаш

Ножницы

Газеты или журналы

1. Разрежьте каждый лист газетной или журнальной бумаги на 4 вертикальные полоски, как показано на изображении. Длину полосок выбирайте сами.

2. Каждую полоску сложите пополам, закрепляя ее внутри клеем.

3. Теперь сложите полоски еще раз пополам, и снова закрепите клеем.

4. Начните скручивать полоски. Делать это нужно плотно. После нескольких движений, наносите каплю клея.

5. Для того, чтобы сделать основу вазы, нужно скрутить как несколько маленьких спиралей, так и одну большую. В данном примере используется второй вариант (большая спираль).

Склейте несколько полосок между собой, чтобы получить одну длинную полоску, которую далее нужно скрутить в большую спираль. Если ваша основа недостаточно большая, просто приклейте к ней столько полосок, сколько вам нужно и добавьте их к спирали.

6. Начните все маленькие спирали склеивать между собой, тем самым собирая вазу.

* Можно таким же способом сделать подставку для чашки или чайника.

Украшаем чемодан газетами и журналами

Вам понадобится:

Старый чемодан

Кисточка

Журналы

Клей ПВА, а еще лучше клей для декупажа

Ножницы или канцелярский нож

1. Из любимых журналов вырежьте понравившиеся изображения, которые потом будут украшать ваш чемодан.

2. Нанесите клей на чемодан и начните аккуратно раскладывать на нем отрывки из журналов.

3. Поверх приклеенных страниц нанесите еще раз клей.

4. Украсьте, таким образом, весь чемодан.

5. С помощью ножниц или канцелярского ножа аккуратно отрежьте лишние части, чтобы все было ровно.

Изделие из газет: букет роз

Вам понадобится:

Ножницы

Клеевой пистолет с горячим клеем (можете попробовать суперклей/клей «Момент»)

Цветочная проволока

1. Из газетного листа вырежьте круг диаметром примерно 10 см.

2. Из круга вырежьте спираль, шириной примерно 2,5-3 см.

3. С внешнего конца спирали начните скручивать бумагу, пока не дойдете до центральной части.

4. Скрученному цветку дайте немного «распуститься» — приспустите спираль.

5. Закрепите цветок горячим клеем.

6. Приготовьте цветочную проволоку, согните один из концов и приклейте к цветку. Конец проволоки можно покрыть кусочком газеты.

7. Сделайте несколько цветков, чтобы получился пышный букет.

8. Соедините все цветы в букет и закрепите проволокой стебли. Если стебли слишком длинные, можете их укоротить при помощи ножниц.

9. Оберните красивой лентой стебли и закрепите ленту клеем.

Плетение из газетных трубочек — очень популярное занятие, и это неудивительно: что-то должно было прийти на смену традиционному плетению из лозы. из бумаги получаются ничуть не хуже, а главное, плетение из трубочек доступно и взрослым, и детям — надо только заготовить побольше материала. Этим мы сегодня и займемся: представляем мастер-класс для начинающих по изготовлению газетных трубочек.

Материалы и инструменты

Бумага. Отправимся на заготовки «бумажной лозы»! Из чего лучше делать трубочки для плетения? Прежде всего из старых газет. Газетная бумага тонкая, хорошо скручивается, отлично впитывает краску. Также подойдет бумага формата А4 низкой плотности (60-65 г/м2). Она называется «газетная» или «потребительская», «писчая».

Кроме этого, для изготовления трубочек можно использовать журналы, старые тетради, кассовую ленту и т.д.

Как резать бумагу
Бумага — волокнистый материал, и у нее, как и у ткани, есть продольное и поперечное направление волокон. Обычно у газет малого формата (57×40 см) волокна проходят вдоль длинной стороны, а большого (84×57 см) — вдоль короткой. У бумаги формата А4 волокна чаще проходят по длинной стороне, но иногда попадается бумага, нарезанная производителями поперек. Прежде чем разрезать на полосы всю пачку, проверьте скручиваемость материала на одном из листов. Положите лист на влажную поверхность — он сам начнет сворачиваться в рулон в продольном направлении. В этом направлении и надо резать.

Клей. Для работы с газетными трубочками можно выбрать любой клей, подходящий для бумаги. Например, ПВА или клей-карандаш. Важно, чтобы он обладал хорошими фиксирующими свойствами, иначе ваши трубочки могут раскрутиться во время покраски.

Густота также имеет значение. Если клей окажется слишком жидким, трубочки будут размокать при наращивании.

Морилки для дерева на водной основе помогут покрасить бумажные трубочки в цвета древесины сосны, клена, дуба, палисандра и даже эбенового дерева. В продаже можно найти около двух десятков оттенков. Существует морилка в порошке, которая перед работой разводится водой.

Смесь строительной грунтовки и колера также очень хорошо подходит для окрашивания трубочек. Перед работой обязательно разбавьте грунтовку водой, как указано в инструкции на флаконе. Имейте в виду, что бумага относится к сильно впитывающим поверхностям.

Чем еще окрасить трубочки
Чтобы придать трубочкам желаемый цвет, можно использовать краски для шерсти, ткани, принтера, пищевые красители, горячий отвар луковой шелухи, зеленку и марганцовку.

Лак. Чтобы ваша работа получилась прочной и не боялась сырости, ее нужно покрыть лаком. Подойдет любой лак для дерева, но в помещении лучше всего использовать акриловый. Он не имеет запаха, после нанесения быстро высыхает и становится прозрачным, образуя защитную пленку.

Спицы и шпажки. Для скручивания бумажных полос в трубочки вам понадобятся спицы разных диаметров — от 1,5 до 4,5 мм — или деревянные шпажки для шашлыка. Трубочки, скрученные на тонкой спице, больше всего похожи на лозу. Они плотные и почти не сминаются во время плетения. А на толстой спице получаются трубочки, которые легко сплющить. И если они скручены из очень тонкой бумаги, то ими можно плести как соломкой.

Ножницы или нож. Один из этих инструментов понадобится вам для разрезания газет на полосы. А вот скрученные трубочки лучше всего подрезать кусачками.

Пульверизатор нужен, чтобы увлажнить пересохшие трубочки: сбрызните их водой и положите в целлофановый пакет. Они снова станут гибкими и послушными. Также пульверизатор можно применять для нанесения краски на поделку.

Кисти используются для покраски готовых поделок и — иногда — трубочек. Вам понадобятся широкая и тонкая кисти.

Прищепки фиксируют трубочки, не дают плетению распуститься и облегчают склеивание деталей.

Шилом делают отверстия, раздвигают ряды плетения, протаскивают между ними трубочки.

Изготовление газетных трубочек

  1. Разрежьте газету вдоль длинной стороны на несколько частей. Две полосы по краям самые ценные, из них получаются белые трубочки. Центральные полосы тоже пойдут в дело. Трубочки с буквами хорошо смотрятся в плетении, подчеркивают необычность материала.

  1. Крутить трубочки лучше всего на столе с шероховатой поверхностью. Приложите к одной стороне бумажной полоски спицу под углом примерно 30°. Если на спице есть ограничитель, то он должен находиться за поверхностью стола.

  1. Уголок газеты заверните под тем же углом и крепко прижмите.

  1. Правой рукой поворачивайте спицу, постепенно скручивая трубочку, левой — придерживайте газету.

  1. На уголок полоски капните немного клея, сверните ее до конца и дайте клею схватиться.

  1. Выньте спицу. Так как мы начинали скручивать полоску со стороны текста, трубочка получилась белой.

Ширина бумажных полос зависит от того, какое изделие вы задумали. Если вы решили сплести что-то крупное, то ширина полосы должна быть 8-10 см. Для маленькой поделки достаточно 6-7 см. Чем уже полоса, тем тоньше должна быть спица. Полосы шириной 10 см лучше всего накручивать на спицу диаметром 2,5 мм. Для полосы шириной 6 см подойдет спица диаметром 1,5 мм.

Наращивание трубочек

Если вы скрутили трубочку правильно, то с одной стороны она будет немного шире, чем с другой. В этом случае для наращивания одну трубочку нужно просто на 1,5-2 см вставить в другую.

Если концы трубочек получились одинаковыми, то для наращивания сложите один конец «уголком» или срежьте его под острым углом.

Чтобы соединение было крепким и надежным, используйте клей.

Окрашивание

Газетные трубочки удобно красить в лоточке с небольшим количеством жидкости или окунать в бутылку с широким горлышком сразу по несколько штук. Можно красить широкой кистью на предварительно покрытой клеенкой поверхности, слегка прокручивая трубочки. Сушить их лучше всего на решетке или сложив поленницей.

Если вы хотите покрасить готовую поделку, делайте это сначала широкой кистью, а затем тонкой, тщательно промазывая щели. Также работе можно придать желаемый цвет с помощью пульверизатора или погрузив ее в емкость с красящим средством и потихоньку поворачивая.

В следующий раз мы сплетем первые фигурки из газетных трубочек.

Комментировать статью «Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер-класс»

Отправить свой рассказ для публикации на сайте можно на

Еще по теме «Поделки из газетных трубочек»:

Поделка по технологии 2 класс «корзина с цветами»: выдали 2 листа, ребенок понял только, что это надо на картон наклеить. А дальше что делать? На одном листе овал, похожий на унитаз «вид сверху», на втором вообще какие-то 3 фигни, одна круглая, другая каплеобразная, третья…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Если бы просто увидела фото без названия статьи — ни за чтоб не догадалась из чего они сделаны.. Комментировать статью » Поделки своими руками из газетных трубочек…

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Вышивка крестиком, бисером, лентами, гладью [ссылка-28] 80. Как сделать паспарту своими руками: декорирование при помощи красок, ткани и других подручных средств.

Как всегда просят поделки. Я сначала сплела гнездо из лыка и веток. Фото есть в паспорте и здесь с инструкцией: [ссылка-1]. Я где-то в стране мастеров видела клетку из газетных трубочек.Я думаю что они еще лучше будут в клетке смотреться. 01.04.2013 15:06:47, нинуля.

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Они плотные и почти не сминаются во время плетения. А на толстой спице получаются трубочки, которые легко сплющить. И если они скручены из очень тонкой бумаги, то ими можно плести как соломкой.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер-класс. Поделки из бумаги своими руками: лопастная вертушка. Приклейте на серединку « цветка » кружок диаметром 3,5 см, вырезанный из черной бумаги.

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Булгакова Светлана. Плетение из газетных трубочек для начинающих: пошаговая Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети.

Готовые поделки из пластиковых трубочек украсят интерьер комнаты. Изготовление газетных трубочек для плетения своими руками. Он не имеет запаха, после нанесения быстро высыхает и становится прозрачным, образуя защитную пленку.

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

Две недели назад Филька научился пить из трубочки -соломки, так теперь это у него культ! Вообще он может пить из чего угодно: из кружки давно, из бутылок даже пьет с узким горлышком, не проливая ни капли! Только с расплескиванием везде проблемы. А вот коробочку сока…

Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс. Эксклюзивные модели. [ссылка-6] 7. Фенечки.ру — Плетение фенечек из мулине; кумихимо и др. [ссылка-7] 8. Авторские схемы Бабочки из пластиковых отходов (Рассказ сына). Лариса Курочкина Татьяна Щур Анна…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Советуем прочитать: сколько спят дети до года. как плести из газетных трубочек для…

Поделки своими руками из газетных трубочек: ежик и совенок. Плетение из газетных трубочек напоминает плетение из лозы, а им издавна занимались даже совсем маленькие дети. Сегодня предлагаем первый урок плетения — мастер-класс по изготовлению из газетных…

Мои руки во время плетения находятся на весу, поэтому быстро устает спина. Приходится часто отдыхать. Но какое наслаждение я получаю от хрустального звона коклюшек! Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

Мои руки во время плетения находятся на весу, поэтому быстро устает спина. Приходится часто отдыхать. Но какое наслаждение я получаю от хрустального звона коклюшек! Газетные трубочки для плетения – своими руками: мастер — класс.

Выберите рубрику HAND MADE (322) hand-made для дачи (18) HANDMADE для дома (57) Мыло своими руками (8) Поделки своими руками (46) Handmade из бросового материала (30) Handmade из бумаги и картона (60) Handmade из природных материалов (25) Бисероплетение. Handmade из бисера (9) Вышивка (111) Вышивка гладью, лентами, бисером (43) Вышивка крестом. Схемы (68) Роспись предметов (12) Handmade к праздникам (217) 8 марта. Подарки HANDMADE (16) Handmade к празднику ПАСХA (42) День Святого Валентина — handmade (26) Новогодние игрушки и поделки (57) Открытки ручной работы (10) Подарки HANDMADE (50) Праздничная сервировка стола (16) ВЯЗАНИЕ (823) Вязание для детей (78) Вязание игрушек (149) Вязание крючком (255) Вязаная крючком одежда. Схемы и описание (44) Вязание крючком. Мелочи и поделки (64) Вязание пледов, покрывал и подушек (65) Салфетки, скатерти и коврики крючком (82) Вязание спицами (36) Вязание сумок и корзинок (58) Вязание. Шапки, шляпы и шарфы (11) Журналы со схемами. Вязание (70) Куколки Амигуруми (57) Украшения и аксессуары (30) Цветы крючком и спицами (78) Домашний очаг (548) Дети — цветы жизни (73) Дизайн интерьера (60) Дом и семья (54) Домоводство (71) Отдых и развлечения (82) Полезные услуги и сайты (96) Ремонт, строительство своими руками (25) Сад и дача (22) Шопинг. Интернет-магазины (65) Красота и Здоровье (222) Движение и спорт (16) Здоровое питание (22) Мода и стиль (81) Рецепты красоты (55) Сам себе лекарь (47) КУХНЯ (99) Вкусные рецепты (28) Кондитерское искусство из марципана и сахарной мастики (27) Кулинария. Сладкая и красивая кухня (44) МАСТЕР-КЛАССЫ (239) Handmade из фетра и войлока (24) Аксессуары, украшения своими руками (39) Декорирование предметов (16) ДЕКУПАЖ (15) Игрушки и куклы своими руками (22) Лепка (38) Плетение из газет и журналов (51) Цветы и поделки из капрона (15) Цветы из ткани (19) Разное (49) Полезные советы (31) Путешествия и отдых (18) ШИТЬЕ (164) Игрушки из носков и перчаток (21) ИГРУШКИ, КУКЛЫ (46) Пэчворк, лоскутное шитье (16) Шитье для детей (18) Шитье для уюта в доме (22) Шитье одежды (14) Шитье сумок, косметичек, кошельков (27)

– это новый вид рукоделия, освоив который вы сможете создавать настоящие шедевры. Современные мастерицы плетут не только корзинки из бумаги, но и красивых зверей, корабли с парусами, домики для кукол и даже кормушки для птиц. Новичкам советуем сначала освоить технику скручивания самих трубочек, а потом попробовать сделать подставку для тетрадей из газет .

Как делать газетные трубочки

Для подготовки трубочек подходит абсолютно разная бумага. Идеальный вариант – чистая офисная, так как она не токсичная и ее намного проще перекрасить в любой другой цвет. Для работы вам понадобится спица, ножницы и клей. Разрежьте лист бумаги на полоски шириной от 7 до 13 см. Чем длиннее будет трубочка, тем лучше, иначе вам придется ее постоянно наращивать. При этом помните, что слишком длинные полоски тоже тяжело закручивать.

Смотрите видео: Как крутить трубочки из газет

Теперь возьмите спицу и начните наматывать на нее полоску бумаги с нижнего уголка. Таким способом вам нужно полностью накрутить бумагу на спицу. Не забудьте зафиксировать край клеем и вытянуть спицу. Можете сразу же покрасить трубочки. Хранить из лучше всего в вертикальном положении, чтобы они не помялись до того времени, когда вы приступите к изготовлению поделки.

Мастер-класс: Подставка под карандаши или тетради

Сделайте достаточное количество трубочек из офисной бумаги или газет. Наметьте ручкой на картонном дне место для расположения трубочек-стоек. Это важно сделать под линейку, чтобы готова поделка была красивой. Чтобы облегчить приклеивание, возьмите двусторонний скотч и наклейте его на дно. Потом по разметке прикладывайте подготовленные трубочки. Сверху нанесите клей-пва и приклейте вторую часть основания. В результате у вас будет красивая заготовка для дна подставки и по 4 трубочки-стойки с узкой стороны, а с широкой – по 9 трубочек для плетения.

Заготовка должна хорошо просохнуть, а потом можете приступить к дальнейшему плетению. Для красоты основание можете оплести красивым шнурком или тесьмой подходящего цвета. Или возьмите газетную трубочку и оплетите дно простым способом. Теперь поднимите все стойки наверх. Для этого трубочку заводите под две соседние и поднимайте. При помощи спицы вы сможете поднять и закрепить две оставшиеся трубочки.

Потом снова возьмите две газетные трубочки и оплетайте стойки веревочкой. Таким методом вам нужно будет оплести около 9 рядов, а потом изменить угол наклона для того чтобы сделать ажурный элемент.

Готовая подставка из трубочек

Также смотрите :

Корзинка и корабль

На первый взгляд, может показаться сложным изготовление корзинок или подставок из газетных трубочек. Но если вы наловчитесь правильно и аккуратно их переплетать, то уже первая поделка у вас будет достаточно красивой.

Из газетных трубочек можно смастерить множество предметов: вазы, горшки для цветов, корзинки, шкатулки, дамские сумочки, и даже предметы мебели.

Работать с этим материалом не сложно, сами по себе трубочки из газет удобные для работы. Они гибкие, поэтому не ломаются. Легко соединяются между собой, а чтобы придать красивого внешнего вида, нужно покрасить краской.

Красить трубочки можно заранее. Для этого краску разводят водой, помещают трубочки до половины, потом переворачивают другой стороной. Подходит краска Морилка для дерева, есть много видов оттенков. Когда трубочки высохнут, можно приступать к работе. Покрасить можно и после сборки работы, пользуясь разными размерами кисти.

Поделки из трубочек своими руками

Такой вид творчества стал очень популярным. Он не требует никаких материальных затрат, старые газеты и журналы есть в каждом доме, их всегда выбрасывают, а можно вместо этого сотворить настоящие шедевры.

Перед работой, следует запастись их достаточным количеством. Можно взять, кроме газет и журналов, старые тетради или тонкие листы А4 плохого качества.


Изготовление трубочек

Для создания трубочек каждая страница газеты разрезается вдоль на четыре равные части. Заранее следует подготовить длинную вязальную спицу, приложить её под углом к кончику газеты. Придерживая за свободный кончик, газету намотать на спицу, после закручивания вынуть её из трубочки, склеить кончик клеем. При работе хорошо придерживать и плотно наматывать, чтобы трубочки не размотались.

Удобнее будет работать, если изготовить трубочки, в которых разные по диаметру кончики легко будет вставить одну трубочку в другую.

В интернете найдется много фото подделок из трубочек, например корзины, стаканчики, предметы мебели, фрукты, звери, по которым можно учиться.

Чтобы работа была эстетичной на вид, нужно тренироваться.

Работу с поделками из трубочек для начинающих можно начать из плетения круглых шкатулок или корзинок.


Корзина, пошаговая инструкция

Начинать нужно с основания. Склеить заранее заготовленные четыре пары длинных трубочек в форме паутины.

Начинаем плетение, чтобы зафиксировать, кончики первой трубочки склеиваем вместе. Делая дно, через каждые два кола, кончики трубочек склеиваем для прочности. Для первого раза, можно упростить работу, вырезать дно из картона и приклеить на него трубочки.

Начиная плести боковые стенки, внутрь поместить сосуд, который подходит по диаметру к корзине, это облегчит работу. Когда корзина достигла желаемой высоты, загнуть кончики, сформировать красивый ободок.

Процесс изготовления происходит методом горизонтального плетения на вертикальные трубочки, которые выходят от основания.

Ваза

Легкая в изготовлении ваза для цветов, для которой понадобится картонная основа от рулона бумажных полотенец, для придания формы вазе.

Изготовление:

Подготовить достаточное количество трубочек из газет. Нанести на картонное основание клей ПВА и приклеить трубочки вертикально, учесть, что трубочки должны быть длиннее, и полностью закрывать картон.

Верх подрезать ровно, или придать другую оригинальную форму. Когда клей полностью высох, покрыть лаком, используя кисть.

Когда навыки работы будут более отточенные, можно приступать к изготовлению поделок не правильных форм. Можно смастерить даже предметы мебели. Чтобы они были прочные, их покрывают лаком.

Мастер-класс поделки из трубочек «Стульчик»

Подготовить:

  • Пластиковый стул, для опоры.
  • Картон.
  • Трубочки из газеты.
  • Клей.

Схема плетения:

Картон поместить под кресло, обрезать до нужного размера, это послужит дном будущего стула. На картонную основу приклеить трубочки довольно плотно, на изгибе клеить под небольшим углом.

Трубочки поднять к верху. Несколькими трубочками закрепить опору, а их кончики спрятать в середину. Для работы, как дополнительные средства, используют прищепки, нити.

Когда доплетете четвертый ряд, можно применять уже по две трубочки одновременно. Соответственно, дно и стойка стульчика готовые. Дальше плетём сидение, используется только одна трубочка.

Спинка стула плетется с левой стороны, понемногу к верху сужается. Лишние кончики обрезаются и прячутся в середину. Для стула можно приделать подлокотники. Обязательно покрыть лаком, для прочности кресла.

Отточив свое мастерство, и научившись хорошо справляться этим видом материала, можно создавать необычные и оригинальные вещи.


Фото поделок из газетных трубочек

Передача сигналов Hedgehog косвенно влияет на выживаемость канальцевых клеток после обструктивного повреждения почек

Am J Physiol Renal Physiol . 2015 1 ноября; 309 (9): F770-8. DOI: 10.1152 / ajprenal.00232.2015. Epub 2015 19 августа. Алиша Раухаузер 1 , Чонгюй Рен 1 , Дунмэй Лу 1 , Бинхуа Ли 1 , Цзили Чжу 2 , Кайла МакЭнери 1 , Комал Ваднагара 1 , Диана Зепеда-Ороско 3 , Синь Дж Чжоу 4 , Фангмин Линь 5 , Антон М Джеттен 6 , Массимо Аттанасио 7

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас;
  • 2 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас; Кафедра нефрологии Уханьского университета, Хубэй, Ухань, Китай;
  • 3 Департамент педиатрии, Университет Айовы, Айова-Сити, Айова;
  • 4 Диагностика почечного пути, патолог, биомедицинские лаборатории и отделение патологии, Медицинский центр Университета Бейлора, Даллас, Техас;
  • 5 Кафедра педиатрии, патологии и клеточной биологии, Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк;
  • 6 Секция клеточной биологии, Отдел внутренних исследований, Национальный институт наук об окружающей среде, Национальные институты здравоохранения, Парк Исследовательского треугольника, Северная Каролина; а также.
  • 7 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас; Юджин Макдермотт Центр роста и развития, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас, Техас [email protected]
Бесплатная статья PMC

Элемент в буфере обмена

Alysha A Rauhauser et al.Am J Physiol Renal Physiol. .

Бесплатная статья PMC Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Am J Physiol Renal Physiol .2015 1 ноября; 309 (9): F770-8. DOI: 10.1152 / ajprenal.00232.2015. Epub 2015 19 августа.

Авторы

Алиша Раухаузер 1 , Чонгюй Рен 1 , Дунмэй Лу 1 , Бинхуа Ли 1 , Цзили Чжу 2 , Кайла МакЭнери 1 , Комал Ваднагара 1 , Диана Зепеда-Ороско 3 , Синь Дж Чжоу 4 , Фангмин Линь 5 , Антон М Джеттен 6 , Массимо Аттанасио 7

Принадлежности

  • 1 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас;
  • 2 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас; Кафедра нефрологии Уханьского университета, Хубэй, Ухань, Китай;
  • 3 Департамент педиатрии, Университет Айовы, Айова-Сити, Айова;
  • 4 Диагностика почечного пути, патолог, биомедицинские лаборатории и отделение патологии, Медицинский центр Университета Бейлора, Даллас, Техас;
  • 5 Кафедра педиатрии, патологии и клеточной биологии, Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк;
  • 6 Секция клеточной биологии, Отдел внутренних исследований, Национальный институт наук об окружающей среде, Национальные институты здравоохранения, Парк Исследовательского треугольника, Северная Каролина; а также.
  • 7 Отделение внутренней медицины Юго-Западного медицинского центра Техасского университета, Даллас, Техас; Юджин Макдермотт Центр роста и развития, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас, Техас [email protected]

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Параметры отображения

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Hedgehog (Hh) — эволюционно законсервированный путь передачи сигналов, который выполняет важные функции в морфогенезе почек и поддержании органов у взрослых.Недавняя работа показала, что передача сигналов Hh реактивируется в почках после повреждения и является важным медиатором прогрессирующего фиброза. Было высказано предположение, что перициты и фибробласты являются основными клетками, которые реагируют на лиганды Hh, и фармакологическое ослабление передачи сигналов Hh рассматривалось как возможное лечение фиброза, но о влиянии ингибирования Hh на эпителиальные клетки канальцев после повреждения почек не сообщалось. . Используя генетически модифицированных мышей, у которых усилена передача сигналов hedgehog из канальцев, и мышей, у которых этот путь условно подавлен в перицитах, которые экспрессируют глиальный белок 2 протеогликанового нейрона (NG2), мы обнаружили, что подавление передачи сигналов Hh связано со снижением инфильтрации макрофагов и канальцевую пролиферацию, но также увеличивает апоптоз канальцев, эффект, который коррелирует со снижением активности канальцевого β-катенина.В совокупности наши данные предполагают сложную функцию передачи сигналов hedgehog после повреждения почек в инициировании как репаративных, так и пропролиферативных процессов выживания.

Ключевые слова: UUO; сигнализация ёжик; травма почек.

Авторские права © 2015 Американское физиологическое общество.

Цифры

Рис. 1.

Повышенная сигнализация hedgehog (Hh) -Gli1 ухудшается…

Рис. 1.

Повышенная передача сигналов hedgehog (Hh) -Gli1 ухудшает интерстициальный фиброз и дилатацию канальцев после одностороннего мочеточника…

Инжир.1.

Повышенная передача сигналов hedgehog (Hh) -Gli1 ухудшает интерстициальный фиброз и дилатацию канальцев после односторонней обструкции мочеточника (UUO). A и B : количественная ОТ-ПЦР в реальном времени в экстрактах целых почек Glis2 + / mut и контрольная экспрессия Shh ( A ) дикого типа, но не Ihh ( B ) увеличена в Glis2 неповрежденных мутантных почках. Показаны репрезентативные изображения почек (окрашивание трихромом) мышей Glis + / mut ( C ) по сравнению с мышами дикого типа ( F ) через 7 дней после UUO.Интерстициальный коллаген (синяя окраска) присутствует диффузно и более выражен вокруг кровеносных сосудов ( C и F , звездочки). Масштабные линейки = 500 мкм. Также показаны коры почек мышей дикого типа ( D ), Glis + / mut ( G ) при большем увеличении, через 7 дней после UUO. В почках мышей Glis + / mut большинство канальцев кажутся расширенными с уплощенным кубовидным эпителием (наконечники стрелок) по сравнению с мышами дикого типа.Звездочки указывают на лучше сохраненные канальцы. Масштабные линейки = 100 мкм. E и H : ложно оперированные почки Glis2 + / mut и мышей дикого типа. Масштабные линейки = 500 мкм. I. Цифровое количественное определение площади расширенных канальцев у мышей Glis2 + / mut и почек дикого типа после UUO ( n = 3 мыши на группу). J : иммунофлуоресцентная микроскопия почек Glis + / mut по сравнению с почками дикого типа через 7 дней после UUO, полученная с использованием антитела против коллагена I.Отложение интерстициального коллагена, количественно определенное анализом цифрового изображения ( K ), увеличивается в почках мышей Glis2 + / mut по сравнению с мышами дикого типа. Масштабная линейка = 50 мкм. L : количественная ОТ-ПЦР в реальном времени коллагена I в почках от мышей Glis2 + / mut и мышей дикого типа. Планки погрешностей — SE; n = 3 мыши / группа. M : гибридизация in situ, показывающая экспрессию Shh и Ihh в почках мышей дикого типа через 7 дней после UUO ( слева, ) по сравнению с ложнооперированными почками ( центр ).После UUO экспрессия Shh в основном повышается в собирательных протоках ( вставка, в вверху слева, ), тогда как экспрессия Ihh обильна в проксимальных канальцах ( вставка в внизу слева ). Смысловые зонды ( справа ) использовали в качестве отрицательного контроля.

Рис. 2.

Повышенная активность Hh-Gli1 связана…

Рис.2.

Повышенная активность Hh-Gli1 связана с увеличением количества интерстициальных фибробластов и макрофагов.…

Рис. 2.

Повышенная активность Hh-Gli1 связана с увеличением количества интерстициальных фибробластов и макрофагов. A : изображения иммунофлуоресцентной микроскопии почек мышей через 7 дней после UUO по сравнению с фиктивным контролем. Антитела против F4 / 80 (зеленый канал) и фибробласт-специфического белка 1 (FSP1; красный канал) использовали в качестве маркеров макрофагов и фибробластов соответственно.И макрофаги, и фибробласты увеличиваются после UUO. Масштабные линейки = 50 мкм. B : обработка ингибитором Hh циклопамином (CPM) снижает количество интерстициальных фибробластов (FSP1) после UUO по сравнению с мышами, получавшими носитель. Ядра контрастировали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Масштабные линейки = 50 мкм. C : количественное определение интерстициальных FSP1-положительных фибробластов, выраженных как фракция положительных клеток. D : обработка СРМ ингибитором Hh снижает количество интерстициальных макрофагов (F4 / 80) после UUO по сравнению с мышами, получавшими носитель. E : цифровой количественный анализ интерстициальных F4 / 80-положительных клеток, выраженный в процентах от иммунореактивной площади. F : обработка СРМ ингибитором Hh снижает количество интерстициальных миофибробластов [α-актин гладких мышц (α-SMA)] после UUO по сравнению с мышами, получавшими носитель. G : цифровая количественная оценка интерстициальных α-SMA-положительных клеток, выраженная в процентах от иммунореактивной площади. Все данные были получены путем усреднения количественной оценки 10 изображений от 3 мышей, получавших CPM, и 3 мышей, получавших носитель в качестве контроля.Планки погрешностей — SE.

Рис. 3.

Лечение CPM связано…

Рис. 3.

Лечение CPM связано со снижением пролиферации канальцевых и интерстициальных клеток…

Инжир.3.

Лечение CPM связано со снижением пролиферации канальцев и интерстициальных клеток, но с увеличением апоптоза канальцев. Типичные изображения иммунофлуоресцентной микроскопии ( A и C ) и количественная оценка ( B и D ) почек мышей, получавших CPM или носитель, через 7 дней после UUO. Антитело против фосфорилированного гистона 3 (pHIS3) использовали для идентификации митотических клеток, а метку ник-конца dUTP-биотина, опосредованную терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL), использовали для обнаружения апоптоза.Апоптотические клетки не наблюдались в интерстиции ( D ). Сообщаемые значения соответствуют проценту положительных клеток от общего числа ядер (среднее значение 10 оптических полей от 3 мышей, получавших CPM, и 3 контрольных). Масштабные линейки = 50 мкм. Планки погрешностей — SE.

Рис. 4.

Условное отключение Smo в…

Рис.4.

Условная инактивация Smo в перицитах, экспрессирующих NG2, приводит к снижению инфильтрации макрофагов…

Рис. 4.

Условная инактивация Smo в перицитах, экспрессирующих NG2, приводит к снижению инфильтрации макрофагов, но не фибробластов, миофибробластов и интерстициального коллагена. Иммунофлуоресцентные микроскопические изображения почек NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl трансгенных мышей с нокаутом через 7 дней после UUO после тамоксифен-опосредованной индукции Cre по сравнению с NG2 -CreER TM ; Smo fl / + показаны гетерозиготные контроли.Антитела против FSP1 и α-SMA использовали в качестве маркеров фибробластов и миофибробластов соответственно. Количество интерстициальных фибробластов ( A ; выражено как процент FSP1-положительных клеток) и миофибробластов ( B ; количественно определено анализом цифрового изображения и выражено как процент иммунореактивной площади α-SMA от общей площади изображения) было уменьшено в NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl почки по сравнению с NG2 -CreER TM ; Smo fl / + контрол.Масштабные линейки = 50 мкм. Изображения и количественная оценка интерстициального коллагена I, полученные с помощью цифрового анализа, выраженные как процент иммунореактивной площади от общей площади изображения ( C ; масштабные полосы = 100 мкм), и определение содержания гидроксипролина в NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl почки по сравнению с NG2 -CreER TM ; Показаны элементы управления Smo fl / + ( D ). Не наблюдалось значительных различий в инфильтрации миофибробластов и интерстициальном коллагене между NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl мышей и гетерозиготных контрольных животных.Также показаны изображения и количественная оценка интерстициальных макрофагов с помощью цифрового анализа ( E ; процент иммунореактивной площади F4 / 80 от общей площади изображения) и количество CD68-положительных клеток ( F ). Масштабные линейки = 50 мкм; n = 3 мыши / группа. Статистические данные получены с помощью теста Стьюдента t . Планки погрешностей — SE в D и SD на всех остальных панелях.

Рис.5.

Условное отключение Smo в…

Рис. 5.

Условная инактивация Smo в перицитах, экспрессирующих NG2, приводит к снижению пролиферации канальцев и…

Рис. 5.

Условная инактивация Smo в перицитах, экспрессирующих NG2, приводит к снижению пролиферации канальцев и увеличению апоптоза клеток канальцев.Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии ( A и C ) почек NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl трансгенных мышей с нокаутом и NG2 -CreER TM ; Smo fl / + показаны контрольные образцы через 7 дней после UUO после индукции Cre, опосредованной тамоксифеном. Количество канальцевых митотических (pHIS3-положительных) клеток было уменьшено в NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl почки по сравнению с NG2 -CreER TM ; Smo fl / + контролей ( A и B ), тогда как количество канальцевых апоптотических клеток, положительных по TUNEL ( C и D ), увеличилось в NG2 -CreER TM ; Smo fl / fl мышей с нокаутом по сравнению с NG2 -CreER TM ; Smo эт / + .Количество пролиферирующих интерстициальных клеток существенно не различалось в двух группах мышей. Результаты выражаются в процентах положительных клеток и были получены при анализе 10 изображений почек на группу; n = 3 мыши / группа. Значения P были рассчитаны с помощью теста Стьюдента t . Планки погрешностей — SE. Масштабные линейки = 50 мкм.

Рис.6.

Связано усиление сигнализации Hh-Gli1…

Рис. 6.

Повышенная передача сигналов Hh-Gli1 связана с активацией канальцевого β-катенина, что предотвращается…

Рис. 6.

Повышенная передача сигналов Hh-Gli1 связана с активацией канальцевого β-катенина, что предотвращается с помощью CPM и условной делеции Smo в перицитах, положительных по глиальному белку 2 (NG2) нейронов. A : изображения иммунофлуоресцентной микроскопии фиктивных и UUO почек через 7 дней после операции, полученные с использованием антитела против β-катенина. Мышам с ложной операцией вводили только носитель; Мышей, прооперированных UUO, лечили CPM или носителем только в качестве контроля. β-Катенин обычно локализован в межклеточных соединениях у фиктивных мышей ( слева, ). После UUO активная цитоплазматическая и ядерная фракции β-катенина увеличивались в нескольких сегментах канальцев ( средний ) в почках мышей, получавших носитель, но не у мышей, получавших CPM ( справа ).Зеленый канал (без первичных антител) был передержан, чтобы выделить контуры канальцев. Ядра контрастировали с DAPI. Масштабные линейки = 50 мкм. B : изображения иммунофлуоресцентной микроскопии канальцевого β-катенина в почках NG2 -CreER; Smo fl / fl мышей по сравнению с NG2 -CreER; Smo fl / + контроль через 7 дней после UUO. Активированный β-катенин восстанавливается в канальцах NG2 -CreER; Smo fl / fl мышей после инактивации Smo по сравнению с NG2 -CreER; Smo эт / + .Масштабные линейки = 50 мкм. C : Вестерн-блоттинг 3 NG2 -CreER; Smo эт / + ( слева ) и 3 NG2 -CreER; Smo фл / фл ( правый ) почки через 7 дней после УУО. Отношение активного (дефосфорилированного по Ser37 или Thr41) к общему количеству β-катенина увеличивается в NG2 -CreER; Smo fl / + по сравнению с NG2 -CreER; Smo фл / фл мышей.

Похожие статьи

  • Активация пути Hedgehog-Gli при фиброзе почек.

    Fabian SL, Penchev RR, St-Jacques B, Rao AN, Sipilä P, West KA, McMahon AP, Humphreys BD. Fabian SL и др. Am J Pathol. 2012 Апрель; 180 (4): 1441-53. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2011.12.039. Epub 2012 17 февраля. Am J Pathol. 2012 г. PMID: 22342522 Бесплатная статья PMC.

  • Передача сигналов Hedgehog-пути регулирует апоптоз линии эпителиальных клеток карциномы толстой кишки HT-29 и секрецию цитокинов.

    Ёсимото А.Н., Бернардацци К., Карнейро А.Дж., Элия С.Ч., Мартинуссо, Калифорния, Вентура Г.М., Кастело-Бранко М.Т., де Соуза Х.С. Ёсимото А.Н. и др. PLoS One. 2012; 7 (9): e45332. DOI: 10.1371 / journal.pone.0045332. Epub 2012 19 сентября. PLoS One. 2012 г. PMID: 23028941 Бесплатная статья PMC.

  • Перициты и иммунные клетки способствуют активации комплемента при тубулоинтерстициальном фиброзе.

    Xavier S, Sahu RK, Landes SG, Yu J, Taylor RP, Ayyadevara S, Megyesi J, Stallcup WB, Duffield JS, Reis ES, Lambris JD, Portilla D. Xavier S, et al. Am J Physiol Renal Physiol. 1 марта 2017 г .; 312 (3): F516-F532. DOI: 10.1152 / ajprenal.00604.2016. Epub 2017 4 января. Am J Physiol Renal Physiol. 2017 г. PMID: 28052876 Бесплатная статья PMC.

  • Передача сигналов Hedgehog играет роль в пролиферации эпителиальных клеток в матке и влагалище новорожденных мышей.

    Накадзима Т., Игучи Т., Сато Т. Накадзима Т. и др. Cell Tissue Res. 2012 Апрель; 348 (1): 239-47. DOI: 10.1007 / s00441-012-1350-7. Epub 2012 3 марта. Cell Tissue Res. 2012 г. PMID: 22388655

  • Морфоген Hedgehog при ишемически-реперфузионном повреждении миокарда.

    Bijlsma MF, Spek CA. Bijlsma MF и др. Exp Biol Med (Maywood).2010 Апрель; 235 (4): 447-54. DOI: 10.1258 / EBM.2009.009303. Exp Biol Med (Maywood). 2010 г. PMID: 20407076 Рассмотрение.

Процитировано

13 статьи

  • Сетевой экспресс-анализ и экспериментальная проверка показывают участие STUB1 в острой травме почек.

    Ши И, Чен Дж, Тэн Дж. Shi Y, et al. Фронт Mol Biosci. 2021 г., 28 июня; 8: 655361. DOI: 10.3389 / fmolb.2021.655361. Электронная коллекция 2021 г. Фронт Mol Biosci. 2021 г. PMID: 34262937 Бесплатная статья PMC.

  • Полисахариды, извлеченные из Balanophora polyandra Griff (BPP), улучшают фиброз почек и EMT за счет ингибирования пути Hedgehog.

    Ли Л., Чжоу Г, Фу Р, Хэ И, Сяо Л., Пэн Ф, Юань К.Ли Л. и др. J Cell Mol Med. 2021 Март; 25 (6): 2828-2840. DOI: 10.1111 / jcmm.16313. Epub 2021 28 января. J Cell Mol Med. 2021 г. PMID: 33507617 Бесплатная статья PMC.

  • Хеджирование против нейропатической боли: роль сигналов ежа в заживлении патологических нервов.

    Моро Н., Буше Ю. Моро Н. и др. Int J Mol Sci. 2020 30 ноября; 21 (23): 9115. DOI: 10.3390 / ijms21239115.Int J Mol Sci. 2020. PMID: 33266112 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

  • Фиброз аллотрансплантата почки: что мы узнали из последних трансляционных исследований.

    Граната С., Бенедетти С., Гамбаро Г., Заза Г. Granata S, et al. J Nephrol. 2020 декабрь; 33 (6): 1201-1211. DOI: 10.1007 / s40620-020-00726-z. Epub 2020 19 марта. J Nephrol. 2020. PMID: 32193834 Рассмотрение.

  • Руксолитиниб снимает почечный интерстициальный фиброз у мышей UUO.

    Бай И, Ван В., Инь П, Гао Дж, На Л., Сунь И, Ван З, Чжан З, Чжао К. Бай Y и др. Int J Biol Sci. 2020 1 января; 16 (2): 194-203. DOI: 10.7150 / ijbs.39024. Электронная коллекция 2020. Int J Biol Sci. 2020. PMID: 31

    8 Бесплатная статья PMC.

Типы публикаций

  • Научно-исследовательская поддержка, Н.I.H., заочная
  • Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

  • Острая травма почек / этиология *
  • Острая почечная недостаточность / генетика
  • Острая травма почек / метаболизм
  • Острая травма / патология почек
  • Острая травма почек / профилактика и борьба
  • Hedgehog Proteins / антагонисты и ингибиторы
  • Hedgehog Proteins / генетика
  • Hedgehog Proteins / метаболизм *
  • Почечные канальцы / эффекты лекарств
  • Почечные канальцы / обмен веществ *
  • Почечные канальцы / патология
  • Круппелоподобные факторы транскрипции / генетика
  • Круппел-подобные факторы транскрипции / метаболизм
  • Белки нервной ткани / генетика
  • Белки нервной ткани / метаболизм
  • Протеогликаны / метаболизм
  • Рецепторы, сопряженные с G-белками / генетика
  • Рецепторы, связанные с G-белком / метаболизм
  • Передача сигнала * / лекарственные эффекты
  • Обструкция мочеточника / осложнения *
  • Veratrum Alkaloids / фармакология
  • бета-катенин / метаболизм

Вещества

  • Факторы транскрипции типа Круппеля
  • Рецепторы, связанные с G-белком
  • хондроитинсульфат протеогликан 4

LinkOut — дополнительные ресурсы

  • Полнотекстовые источники

  • Другие источники литературы

  • Базы данных молекулярной биологии

[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

Sonic Hedgehog — новый канальцевый фактор роста интерстициальных фибробластов после повреждения почек

Abstract

Трубчатый эпителий составляет большую часть паренхимы почек и является основной мишенью для различных повреждений почек.Однако то, как поврежденные канальцы управляют активацией и пролиферацией интерстициальных фибробластов, остается малоизученным. Здесь мы исследовали роль sonic hedgehog (Shh), секретируемого внеклеточного сигнального белка, в пролиферации фибробластов. Shh индуцировалась в эпителии почечных канальцев на животных моделях ХБП, индуцированных ишемией / реперфузионным повреждением (IRI), адриамицином или удалением почечных масс, а также в почечных канальцах биоптатов почек от пациентов с ХБП различной этиологии. Используя репортерных мышей Gli1-CreER T2 , мы идентифицировали интерстициальные фибробласты как основные мишени передачи сигналов Shh почек in vivo . In vitro , инкубация с Shh способствовала нормальной пролиферации фибробластов почек крысы, которую оценивали с помощью подсчета клеток, анализа MTT и анализа включения BrdU, и стимулировала индукцию многочисленных генов, связанных с пролиферацией. Однако Shh не влиял на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев. In vivo сверхэкспрессия Shh способствовала размножению фибробластов и усугубляла фиброзные поражения почек после IRI. Соответственно, блокада передачи сигналов Shh циклопамином, низкомолекулярным ингибитором Smoothened, ингибировала пролиферацию фибробластов, уменьшала накопление миофибробластов и ослабляла почечный фиброз.Эти исследования идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный фактор роста канальцев, который способствует пролиферации и активации интерстициальных фибробластов. Наши данные также предполагают, что блокада передачи сигналов Shh является вероятной стратегией терапевтического вмешательства при почечном фиброзе.

Ключевые слова: фиброз почек, хроническое заболевание почек, фибробласт, пролиферация клеток, ультразвуковой еж.

Фиброз почек, конечный общий исход широкого спектра ХБП, характеризуется активацией продуцирующего матрикс, α — гладкомышечный актин ( α -SMA) -положительные миофибробласты, непрекращающееся производство и отложение внеклеточного матрикса и прогрессирующее образование фиброзных рубцов. 1 3 Хотя миофибробласты могут происходить из разных источников, таких как костный мозг, эндотелий и канальцевый эпителий, локальная пролиферация резидентных фибробластов остается основным путем, ведущим к активации и расширению популяции миофибробластов в больные почки. 4 6 В этом контексте идентификация ключевых медиаторов, которые контролируют пролиферацию почечных фибробластов и определение основных механизмов, будет иметь важное значение для раскрытия патогенного механизма почечного фиброза и разработки рациональных стратегий вмешательства. 7

В нормальных почках взрослого человека канальцевый эпителий составляет основную часть паренхимы почек. Обширные исследования показали, что тубулярные клетки особенно уязвимы для широкого спектра метаболических, иммунологических, ишемических и токсических поражений, и в большинстве случаев они являются основной мишенью для различных повреждений почек. 8 11 Эти наблюдения предполагают, что повреждение канальцев часто является ранним и центральным событием, которое запускает расширение фибробластов и интерстициальный фиброз. 10 , 12 , 13 Однако, как именно поврежденные канальцы вызывают пролиферацию и активацию фибробластов в соседнем интерстиции, остается малоизученным. Одна правдоподобная гипотеза заключается в том, что поврежденные канальцы продуцируют и секретируют внеклеточные сигнальные белки, которые паракринным образом определяют пролиферацию фибробластов. Однако идентичность такого митогенного фактора, происходящего из канальцев, для интерстициальных фибробластов остается в значительной степени неуловимой.

Sonic hedgehog (Shh), наиболее изученный член лигандов сигнального пути hedgehog, представляет собой секретируемый внеклеточный сигнальный белок, который играет фундаментальную роль в регуляции ряда онтогенетических процессов в органогенезе млекопитающих. 14 , 15 Во время развития почек Shh контролирует экспрессию иерархии генов, участвующих в формировании паттерна ткани и регуляции клеточного цикла. 16 19 Соответственно, мутации в гене Shh были связаны с дефектами развития почек, что привело к гипоплазии почек у мышей. 20 , 21 В нормальных почках взрослого человека уровень экспрессии Shh чрезвычайно низок и практически не обнаруживается. 22 Вопрос о том, изменяется ли экспрессия Shh в пораженных почках, остается спорным. Хотя мы сообщаем, что Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при обструктивной нефропатии после односторонней обструкции мочеточника (UUO), 22 другое исследование показывает, что он не изменяется во время UUO. 23 Тем не менее, фактор транскрипции Gli1, прямая нижестоящая мишень и репортер активной передачи сигналов hedgehog, специфически индуцируется в почечных интерстициальных фибробластах фиброзных почек. 22 , 23 Мы ранее предположили, что происходящий из канальцев Shh обеспечивает эпителиально-мезенхимальную коммуникацию (EMC) путем избирательного воздействия на интерстициальные фибробласты, что приводит к их переходу в миофибробласты. 22 Однако остается неизвестным, действует ли Shh также как митоген и регулирует пролиферацию фибробластов, которая может приводить к увеличению популяции клеток, продуцирующих матрикс.

В этом исследовании мы исследовали регуляцию Shh на трех моделях фиброзных заболеваний почек, а также на биопсиях почек человека от пациентов с ХЗП.Наши результаты показывают, что повышающая регуляция Shh является частой находкой при CKD и что Shh избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro . Мы также показываем, что сверхэкспрессия Shh или блокада его передачи сигналов с помощью низкомолекулярного ингибитора оказывает драматическое влияние на тяжесть почечного фиброза после повреждения почек in vivo . Эти результаты подтверждают, что происходящий из канальцев Shh является индуцибельным, специфическим и мощным митогеном фибробластов, который контролирует пролиферацию почечных фибробластов и фиброз почек.

Результаты

Тубулярная индукция Shh является частым обнаружением в различных моделях ХБП

Чтобы изучить регуляцию Shh после повреждения почек, мы изучили три модели ХБП на животных, индуцированных ишемией / реперфузией почек, адриамицином (ADR) или субтотальным почечным кровотоком. массовая абляция. Эти модели хорошо зарекомендовали себя и широко используются, и они представляют различную этиологию, приводящую к фиброзу почек. 9 , 24 27 Как показано в, количественный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) показал, что мРНК Shh почек заметно индуцировалась через 10 дней после ишемии / реперфузионного повреждения (IRI) по сравнению с с фиктивным управлением.Соответственно, белок Shh также значительно индуцировался в поврежденных почках после IRI, что было показано с помощью вестерн-блоттинга лизатов цельной почки (2). Точно так же уровни мРНК Shh в почках () и уровни белка () были значительно повышены через 5 недель после введения ADR.

Индукция Shh часто встречается в моделях на животных с ХЗП. (A) Анализ qRT-PCR показывает значительную индукцию экспрессии мРНК Shh в фиброзных почках после почечного IRI в течение 10 дней. * P <0.05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (B и C) Вестерн-блоттинг почечной экспрессии белка Shh в ложных и поврежденных почках через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (B) Вестерн-блоттинг и (C) количественные данные. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0,05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (D) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показывает повышенную экспрессию Shh в мышиных моделях IRI (10 дней) и нефропатии ADR (5 недель).На нижней панели увеличены области, выделенные рамкой. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. (E) Экспрессия мРНК Shh в почках при нефропатии ADR. Экспрессию мРНК Shh оценивали в почках через 5 недель после инъекции ADR. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 5). (F и G) Вестерн-блоттинг почечного белка Shh через 5 недель после инъекции ADR. Представлены репрезентативные (F) Вестерн-блоттинг и (G) количественные данные. Цифры (1–5) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0.05 по сравнению с контролями ( n = 5). (H и I) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показало индукцию белка Shh в модели остаточной почки крысы после нефрэктомии 5/6 через 12 недель. Масштабная линейка, 50 µ м. (J) Идентификация интерстициальных фибробластов как hedgehog-реагирующих клеток в фиброзных почках. Трансгенных мышей Gli1-CreER T2 подвергали IRI в течение 10 дней, а почки подвергали двойному иммуноокрашиванию на Cre-рекомбиназу (красный) и различные маркеры, специфичные для типа клеток (зеленый).Стрелки, CD45- или CD31-положительные клетки; стрелки, Cre-позитивные клетки; широкие стрелки — клетки с положительным окрашиванием как на вементин, так и на Cre. Масштабная линейка, 20 µ м. (K) Диаграмма показывает, что Shh из канальцев специфически нацеливается на интерстициальные фибробласты после повреждения почек. GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол.

Далее мы исследовали экспрессию и локализацию белка Shh в фиброзных почках на различных моделях ХЗП. Как показано на фиг.4, иммуногистохимическое окрашивание специфическим антителом показало, что в ложнооперированных контрольных почках обнаруживается мало или совсем отсутствует белок Shh.Однако заметная индукция белка Shh была четко очевидна в фиброзных почках после повреждения IRI или ADR. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев (, стрелки), тогда как интерстициальные клетки в увеличенном интерстиции были в основном отрицательными для окрашивания Shh. Следует отметить, что окрашивание Shh не происходило в присутствии антигена Shh, что указывает на специфичность этого окрашивания (дополнительный рисунок 1). Точно так же на модели остаточной почки крысы почечный белок Shh резко индуцировался через 12 недель после нефрэктомии 5/6 по сравнению с фиктивным контролем ().Эти результаты позволяют предположить, что индукция Shh, специфическая для канальцев, является частой находкой в ​​различных моделях ХБП на животных.

Трубчатое происхождение Shh нацелено на интерстициальные фибробласты

In vivo

Более ранние исследования идентифицировали почечные интерстициальные фибробласты как клетки, отвечающие за «еж» в фиброзных почках. 22 , 23 Для дальнейшего решения этой проблемы мы использовали трансгенных мышей Gli1-CreER T2 , у которых слитый белок Cre-ERT2, состоящий из рекомбиназы Cre и мутантного рецептора эстрогена, находится под контролем эндогенного Gli1. элементы промотора / энхансера.По существу, Cre экспрессируется исключительно в Gli1-экспрессирующих клетках, тем самым указывая на клетки-мишени для передачи сигналов hedgehog у этих мышей. 28 , 29 Мы обнаружили, что через 10 дней после IRI Cre экспрессировался в интерстициальных клетках почек, но не в клетках канальцев. Двойное иммуноокрашивание показало, что Cre (, красный) был окрашен виментином (маркер фибробластов) (, зеленый), но не CD45 (общий маркер лейкоцитов) или CD31 (маркер эндотелиальных клеток) (). Следовательно, как показано на фиг., Эти результаты предполагают, что происходящий из канальцев Shh специфически нацелен на интерстициальные фибробласты в пораженных почках.

Повышенная экспрессия Shh в почечных канальцах ХБП человека

Чтобы установить клиническую значимость регуляции Shh для патогенеза ХЗП человека, мы исследовали его экспрессию в образцах биопсии почек от пациентов с различными ХБП. Как показано на фиг.2, белок Shh практически не обнаруживается в нормальных почках человека (проверено два случая). Однако белок Shh был заметно индуцирован во всех 10 образцах биопсии от пациентов с ХБП, что было показано иммуногистохимическим окрашиванием. Диагноз и демографические данные пациентов представлены в дополнительной таблице 1.показаны типичные микрофотографии окрашивания Shh в срезах почек пациентов с IgA-нефропатией, мембранозным нефритом и ФСГС. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев больных почек человека (, стрелки). Иногда жидкости в просвете почечных канальцев также окрашиваются положительно на Shh, что позволяет предположить, что он может секретироваться канальцевыми клетками. Помимо канальцевых клеток, некоторые клубочковые подоциты также были положительными по окрашиванию Shh (данные не показаны). Однако почечные интерстициальные клетки были практически отрицательными для окрашивания Shh.Эти данные указывают на то, что Shh является индуцибельным секретируемым фактором, происходящим из канальцев, который может играть роль в патогенезе ХЗП человека.

Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при ХЗП человека. Образцы биопсии почек человека иммуногистохимически окрашивали специфическими антителами против белка Shh. Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию белка Shh при ХЗП человека. Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля.Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. Масштабная линейка, 50 мкм м.

Shh избирательно способствует пролиферации почечных фибробластов

In vitro

Поскольку интерстициальные фибробласты являются основными мишенями Shh, происходящего из канальцев, в фиброзных почках (), мы затем исследовали его потенциальное действие в интерстициальных фибробластах почек in vitro . С этой целью нормальные интерстициальные фибробласты почек крысы (NRK-49F) инкубировали с различными концентрациями рекомбинантного человеческого белка Shh в течение различных периодов времени, как указано.После обработки Shh наблюдалось заметное увеличение плотности клеток NRK-49F, что показано на фазово-контрастных изображениях в. Подсчет клеток показал, что Shh существенно увеличивает количество клеток NRK-49F в зависимости от дозы () и времени (), предполагая, что Shh действует как мощный митоген, который способствует пролиферации почечных фибробластов. Аналогичные результаты были получены при использовании количественного колориметрического анализа [3-4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (). Мы также оценили способность Shh стимулировать вхождение почечных фибробластов в клеточный цикл и синтез ДНК, что отражалось включением бромдезоксиуридина (BrdU).Как показано на фиг.4, повышенное включение BrdU наблюдалось в клетках NRK-49F после инкубации с Shh в течение 48 часов по сравнению с контролем. Как и ожидалось, Shh был способен индуцировать свою нижестоящую цель Patched-1 (Ptch2) (), а также экспрессию Gli1 и α -SMA в клетках NRK-49F (данные не показаны), как сообщалось ранее. 22

Shh избирательно способствует пролиферации клеток фибробластов in vitro . (A) Типичные микрофотографии показывают фазово-контрастные изображения почечных интерстициальных фибробластов после инкубации с рекомбинантным Shh.NRK-49F инкубировали в течение 3 дней с разными концентрациями Shh, как указано. (B и C) Shh способствует пролиферации фибробластов в зависимости от дозы и времени. Клетки NRK-49F инкубировали с (B) различными концентрациями Shh в течение 3 дней или (C) с фиксированной дозой Shh (100 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано. Подсчитывали и представляли количество клеток (× 1000 на лунку). * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (D) Графическое представление показывает, что Shh способствует пролиферации клеток NRK-49F, оцененной с помощью колориметрического анализа МТТ.* P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (E) Типичные микрофотографии показывают, что Shh способствует синтезу ДНК фибробластов, о чем свидетельствует включение BrdU. Клетки NRK-49F инкубировали с 50 и 100 нг / мл Shh в течение 2 дней. Клетки иммуноокрашивали мышиным антителом против BrdU (красный). SYTO-Green (зеленый) использовался для визуализации ядер. Стрелки указывают на BrdU-положительные клетки. (F) Количественное определение процента BrdU-положительных клеток после обработки Shh. * P <0.05 по сравнению с контролями ( n = 3). (G) Ptch2 экспрессируется в почечных фибробластах и ​​индуцируется Shh. Клетки NRK-49 F обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 24 часов или 50 нг / мл Shh в течение различных периодов времени, как указано. (H – J) Shh не способствует пролиферации клеток проксимальных канальцев почек. Клетки HKC-8 инкубировали с (H) 100 нг / мл Shh в течение различных периодов времени или (I и J) с разными концентрациями Shh в течение 3 дней. Клеточную пролиферацию оценивали с помощью (H и I) подсчета количества клеток или (J) колориметрического анализа МТТ.(K) Вестерн-блоттинг показывает, что Shh способствует экспрессии множества генов, связанных с пролиферацией, в фибробластах. Клетки NRK-49F инкубировали с Shh (50 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано. Лизаты клеток подвергали Вестерн-блоттингу на c-myc, c-fos, PCNA и актин.

Мы также исследовали, влияет ли Shh на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев, в которых Shh активируется (и). С этой целью клетки проксимальных канальцев человека (HKC-8) и клетки внутреннего мозгового собирательного протока мыши (mIMCD-3) инкубировали с различными дозами Shh в течение различной продолжительности.Как показано в, Shh не оказывал влияния на пролиферацию клеток HKC-8. Точно так же Shh также не способствует пролиферации клеток mIMCD-3 (дополнительный рисунок 2). Фактически, он проявлял небольшое, но значительное ингибирование клеток mIMCD-3, как оценивалось с помощью анализа МТТ (дополнительная фигура 2C). Следовательно, очевидно, что происходящий из канальцев Shh избирательно нацелен на интерстициальные фибробласты, но не на эпителиальные клетки канальцев, и способствует пролиферации фибробластов в качестве мощного митогена.

Shh активирует гены, связанные с пролиферацией в фибробластах

Чтобы очертить механизм, лежащий в основе Shh-опосредованной пролиферации фибробластов, мы затем исследовали экспрессию многочисленных генов, связанных с пролиферацией, в клетках NRK-49F.Как показано на фиг.3, как c-Myc, так и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) быстро индуцировались Shh в клетках NRK-49F уже через 0,5 часа после обработки. Хотя индукция c-Myc была временной, повышенная регуляция PCNA поддерживалась на протяжении всех экспериментов. Экспрессия c-fos, основного компонента факторов транскрипции AP-1, также индуцировалась Shh в зависимости от времени (). Эти результаты предполагают, что Shh может быстро активировать несколько генов, связанных с пролиферацией, в интерстициальных фибробластах почек, что приводит к усилению пролиферации клеток.

Сверхэкспрессия Shh

in vivo ускоряет AKI до прогрессирования ХБП

Учитывая способность Shh стимулировать пролиферацию фибробластов in vitro , мы попытались изучить, влияет ли избыточная экспрессия экзогенного Shh in vivo на пролиферацию фибробластов и их прогрессирование. фиброз после ОПП. С этой целью мы использовали мышиную модель IRI, в которой в тканях почек развиваются фиброзные поражения в поздние сроки после ишемической AKI. 9 , 26 Как показано на рисунке, вектор экспрессии Shh (pFlag-Shh) или пустой контрольный вектор (pcDNA3) вводили через 3 дня после IRI с помощью метода переноса генов на основе гидродинамики, подход, который приводит к значительным почечная экспрессия трансгена. 30 , 31 Анализы RT-PCR показали, что мРНК для Shh и его нижележащего гена-мишени Gli1 индуцировалась через 7 дней после однократной инъекции Shh-экспрессирующей плазмиды (через 10 дней после IRI) (). Также индуцировался белок Shh, о чем свидетельствовал вестерн-блот-анализ лизатов цельной почки с использованием антител против Shh или против Flag (). Иммуногистохимическое окрашивание показало, что белок Shh преимущественно индуцировался в эпителии почечных канальцев после инъекции плазмиды (). Сходным образом почечная экспрессия эндогенного белка Gli1 также индуцировалась после сверхэкспрессии экзогенного Shh ().Следовательно, доставка генов на основе гидродинамики приводит к сверхэкспрессии Shh в эпителии почечных канальцев in vivo после IRI.

Shh экспрессируется в эпителии почечных канальцев in vivo после гидродинамического переноса гена. (A) Экспериментальный план. Красные стрелки указывают момент почечного IRI. Белые и красные стрелки указывают моменты времени, когда вводили pcDNA3 или pFlag-Shh соответственно. (B) ОТ-ПЦР показывает экспрессию мРНК Shh и Gli1 в почках через 7 дней после инъекции одной плазмиды.(C и D) Вестерн-блоттинг экспрессии почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды. Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против Shh, Flag или α -тубулина. Представлены репрезентативные (C) вестерн-блоттинг и (D) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3. Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (E) Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях.Масштабная линейка, 50 мкм м. (F) Репрезентативные вестерн-блоты показывают экспрессию почечного белка Gli1 через 7 дней после инъекции плазмиды.

Мы обнаружили, что сверхэкспрессия Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток почек и ускоряет прогрессирование почечного фиброза. Как показано на фиг.4, экзогенный Shh стимулирует исключительно пролиферацию клеток в интерстициальном компартменте почек, но не в сегментах канальцев, что было проиллюстрировано иммуногистохимическим окрашиванием на Ki67-положительные клетки.Это увеличение пролиферации интерстициальных клеток почек тесно коррелировало с повышенной экспрессией мРНК генов интерстициального матрикса, таких как коллагены I и III типов (2). Соответственно, уровни почечного белка рецептора фактора роста тромбоцитов- β (PDGFR- β ), десмина и α -SMA, характерных маркеров активных миофибробластов, 1 , 3 , также были заметно индуцированный (). Между тем, сверхэкспрессия Shh ускоряет накопление и отложение основных белков интерстициального матрикса, таких как фибронектин, в поврежденных почках (5), что было показано вестерн-блоттингом лизатов цельной почки.Соответственно, окрашивание трихромом по Массону (MTS) показало, что экзогенный Shh in vivo усугубляет фиброзные поражения почек после IRI ().

Сверхэкспрессия экзогенного Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток и ускоряет прогрессирование почечного фиброза после AKI. (A) Типичные микрофотографии показывают иммуногистохимическое окрашивание на Ki67 через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Желтые стрелки указывают на Ki67-положительные клетки.Масштабная линейка, 50 мкм м. (B) Количественное определение Ki67-положительных клеток в почечных канальцах и интерстициальных компартментах. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3. HPF, поле большой мощности. (C и D) анализы qRT-PCR показывают, что сверхэкспрессия Shh in vivo способствовала почечной экспрессии (C) коллагена I и (D) коллагена III после IRI. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3 ( n = 4–6). (E) Вестерн-блоттинг экспрессии в почках различных генов, связанных с фиброзом.Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу со специфическими антителами против PCNA, PDGFR- β , десмина, фибронектина, α -SMA и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (F и G) Графическое представление уровней почечного белка различных генов, связанных с фиброзом. Данные представлены в виде кратной индукции по сравнению с контролями pcDNA3. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3; ** P <0,01 по сравнению с pcDNA3. (H) Типичные микрофотографии показывают отложение коллагена в почках через 7 дней после инъекции плазмиды.Парафиновые срезы подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на область депонирования коллагена с синим окрашиванием. Масштабная линейка 150 мкм м. (I) Графическое представление показывает фиброзные поражения почек через 7 дней после инъекции плазмиды после количественного определения. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3.

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек

Далее мы исследовали, может ли блокада передачи сигналов Shh подавлять пролиферацию фибробластов и уменьшать почечный фиброз.С этой целью мы оценили терапевтическую эффективность циклопамина (CPN), низкомолекулярного ингибитора Smoothened (Smo), 22 , 32 при установленном повреждении почек, вызванном IRI. Как показано на фиг.3, CPN вводили путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций, начиная с 3 дней после IRI, момента времени, когда функция почек начинает восстанавливаться после AKI. 33 Как показано на фиг. 9, почечная экспрессия мРНК Gli1, прямой нижестоящей мишени и репортерного гена передачи сигналов hedgehog, была существенно ингибирована через 7 дней после введения CPN (10 дней после IRI) in vivo .Точно так же экспрессия почечного белка Gli1 также снижалась после обработки CPN (). Эти данные показывают, что CPN эффективен в блокировании передачи сигнала Shh in vivo . Однако не наблюдалось значительных изменений в экспрессии мРНК Gli2 и Gli3 в почках (дополнительный рисунок 3).

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек после IRI. (A) Экспериментальный план. Зеленые стрелки указывают на инъекцию CPN, тогда как белые стрелки указывают на инъекцию носителя. (B) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует экспрессию мРНК Gli1 в почках.* P <0,05 по сравнению с фиктивными контролями; P <0,05 по сравнению с автомобилями ( n = 3). (C) Репрезентативные вестерн-блоттинги показывают экспрессию почечного белка Gli1 в различных группах, как указано. Лизаты почек иммуноблотировали с антителами против Gli1 и актина. Veh, автомобиль. (D) Репрезентативные микрофотографии показывают, что CPN улучшает фиброзные поражения почек после IRI. Срезы почек подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на нижних панелях. Стрелками обозначены фиброзные участки с синим окрашиванием.Масштабная линейка, 50 мкм м. (E) Количественное определение фиброзных поражений почек в разных группах. Фиброзные поражения почек (определяемые как процент MTS-положительной фиброзной области) количественно оценивали с помощью компьютерного морфометрического анализа. P <0,05 по сравнению с автомобилями. (F – I) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует почечную экспрессию (F) коллагена I, (G) коллагена III, (H) фибронектина и (I) α -SMA после IRI. * P <0,05 по сравнению с фиктивными контролями; P <0.05 по сравнению с транспортными средствами ( n = 3–5).

Мы дополнительно оценили тяжесть почечного фиброза на этой модели после инъекций CPN. Как представлено в, MTS выявила меньшее количество фиброзных поражений и снижение отложения коллагена в почках, получавших CPN, по сравнению с контрольными носителями. Соответственно, почечная экспрессия основных генов интерстициального матрикса, таких как коллагены I и III типов и фибронектин, заметно снижалась после введения CPN (2). Экспрессия α -SMA, маркера-сигнатуры активных миофибробластов, также ингибировалась обработкой CPN ().Эти данные показывают, что блокирование передачи сигналов Shh способно улучшить повреждение почек и предотвратить прогрессирование почечного фиброза после IRI.

Блокада передачи сигналов Shh избирательно ингибирует пролиферацию почечных фибробластов

In vivo

Чтобы изучить механизм, лежащий в основе положительного эффекта CPN, мы исследовали его роль в модулировании пролиферации и размножения почечных фибробластов in vivo . Как показано на фиг.1, экспрессия белка PCNA значительно ингибировалась CPN в фиброзных почках через 10 дней после IRI по сравнению с контрольными носителями.Чтобы определить источники почечных пролиферирующих клеток, мы провели двойное иммуноокрашивание на Ki67 (, красный) и ламинин (, зеленый), основной компонент базальной мембраны канальцев. Как показано стрелками, большинство Ki67-положительных клеток было локализовано в интерстициальном компартменте, что указывает на преимущественное увеличение популяции интерстициальных клеток в этот момент времени (10 дней) после IRI. Интересно, что CPN избирательно ингибирует пролиферацию интерстициальных клеток (), но не влияет на пролиферацию канальцевых клеток ().

Блокада передачи сигналов Shh избирательно подавляет пролиферацию интерстициальных фибробластов почек. (A и B) Вестерн-блоттинг показывает, что CPN ингибирует экспрессию PCNA в почках через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (A) Вестерн-блоттинг и (B) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с носителем. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (C) Типичные микрофотографии показывают, что CPN ингибирует пролиферацию интерстициальных клеток почек после IRI. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на Ki67 (красный) и ламинин (зеленый) показывает, что Ki67-положительные клетки преимущественно локализовались в интерстициальном компартменте.Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на правых панелях. Стрелки указывают на Ki67-положительные клетки в интерстиции, тогда как стрелки обозначают канальцевые клетки с Ki67-положительным окрашиванием. Масштабная линейка, 50 мкм м. (D и E) CPN избирательно ингибирует пролиферацию интерстициальных, но не канальцевых клеток in vivo после IRI. Приведены количественные данные о Ki67-положительных клетках в интерстициальном (D) и канальцевом (E) компартментах. * P <0,05 по сравнению с носителем. (F и G) Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание показывает определение Ki67 (красный) и различных клеточных маркеров (зеленый) в почках через 10 дней после IRI.Используемые маркеры, специфичные для определенного типа клеток, включают CD31 (эндотелиальные клетки), CD45 (лейкоциты) и α -SMA (миофибробласты). Количественные данные о стоимости для Ki67 и различных маркеров, специфичных для типов клеток, представлены в G. DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол. (H – J) Вестерн-блоттинг почечного PDGFR- β , десмина, фибронектина. и экспрессия α -SMA через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (H) Вестерн-блоттинг и (I и J) количественные данные. * P <0.05 по сравнению с автомобилем. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. Fn, фибронектин. (K) Типичные микрофотографии иммуногистохимического окрашивания показывают, что CPN ингибирует экспрессию PDGFR- β в почках и экспрессию десмина после IRI. Стрелки указывают положительные клетки. Масштабная линейка, 50 мкм м. HPF, поле большой мощности.

Для дальнейшего выяснения идентичности этих пролиферирующих интерстициальных клеток мы выполнили дополнительное определение стоимости для Ki67 (, красный) и различных маркеров, специфичных для типа клеток (, зеленый).Как показано в, не было определения стоимости Ki67 и CD31, специфического маркера эндотелиальных клеток. Точно так же наблюдалась небольшая стоимость Ki67 и CD45, общего лейкоцитарного маркера. Однако Ki67 в основном колокализован с α -SMA, маркером миофибробластов (, стрелки). Количественное определение показало, что более 80% Ki67-положительных клеток были α -SMA-положительными миофибробластами в пораженных почках после IRI (), что свидетельствует о преимущественной пролиферации фибробластов через 10 дней после IRI.Следовательно, CPN в значительной степени нацелился на фибробласты и избирательно предотвращал их пролиферацию и рост.

В соответствии со сниженной пролиферацией фибробластов обработка CPN также ингибировала экспрессию PDGFR- β и десмина, двух сигнатурных белков, которые определяют активацию фибробластов. Как проиллюстрировано анализом вестерн-блоттинга, уровень PDGFR- β в почках и десмин значительно снизились после инъекции CPN по сравнению с контрольными носителями (). Иммуногистохимическое окрашивание также выявило заметное подавление экспрессии PDGFR- β и десмина с помощью CPN ().Соответственно, CPN также значительно ингибирует почечную экспрессию α -SMA и белков фибронектина (). Эти результаты показывают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью CPN снижает фиброз почек за счет избирательного ингибирования пролиферации и активации фибробластов в пораженных почках.

Обсуждение

Пролиферация и активация интерстициальных фибробластов являются основными и частыми патологическими признаками ХЗП, которые в конечном итоге приводят к увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках.Однако идентичность и источники внеклеточных сигналов, которые контролируют пролиферацию фибробластов, остались плохо изученными. Результаты, представленные в этом исследовании, показывают, что Shh, происходящий из канальцев, является новым, индуцибельным и мощным митогеном, который специфически способствует пролиферации фибробластов в соседнем интерстиции. Этот вывод подтверждается множественными линиями in vitro и in vivo доказательств. Наши данные иллюстрируют решающую роль Shh в регуляции разрастания фибробластов и фиброза почек после повреждения почек, в первую очередь через посредничество EMC.

Shh является прототипом трех лигандов в сигнальной системе hedgehog. Это секретируемый белок, модифицированный холестерином и пальмитоилом, и он действует как классический морфоген, вещество, регулирующее формирование тканевого паттерна во время развития млекопитающих. 34 , 35 Shh проявляет свое действие через связывание с рецептором плазматической мембраны Ptch2, что приводит к интернализации и деградации Ptch2, что приводит к дерепрессии семимембранного G-белка, подобного рецептору Smo. 17 , 36 В нормальных почках взрослого человека ген Shh относительно неподвижен, и его экспрессия практически не обнаруживается у мышей, крыс и людей (и). Однако экспрессия Shh явно индуцируется преимущественно в эпителии почечных канальцев после повреждения почек. Следует отметить, что, хотя мы ранее показали индукцию Shh в UUO мыши, 22 , в другом отчете указано, что она не изменилась в той же модели. 23 Точная причина такого несоответствия остается неизвестной, но это может быть связано с конкретной используемой методологией.Fabian et al. 23 оценивали экспрессию Shh только с помощью ОТ-ПЦР, подхода, который подвержен вариациям специфичности праймеров и условий эксперимента. Напротив, наши результаты по индукции Shh после UUO были показаны с помощью комбинации ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и иммуногистохимического окрашивания. 22 Используя три дополнительных модели почечного фиброзного заболевания, мы теперь подтвердили, что Shh индуцируется в пораженных почках после IRI, ADR и абляции почечной массы ().Кроме того, Shh также индуцируется в биоптатах почек человека от пациентов с различными заболеваниями почек с различной этиологией (), что свидетельствует о клинической значимости индукции Shh для возникновения и прогрессирования заболеваний почек человека. Взятые вместе, наши данные показывают, что экспрессия Shh индуцируется во всех четырех моделях животных (UUO, IRI, ADR-нефропатия и остаточная почка после нефрэктомии 5/6), протестированных и у людей с ХБП, что указывает на то, что индукция Shh является универсальным и частым явлением в патогенез широкого спектра ХБП.

Хотя Shh преимущественно индуцируется в эпителии почечных канальцев пораженных почек, он избирательно нацеливается и специфически способствует пролиферации интерстициальных фибробластов (и). Это открытие согласуется с более ранними сообщениями об использовании Gli1 LacZ мышей, у которых почечный Gli1 избирательно индуцируется в активных фибробластах в интерстициальном компартменте после UUO. 22 , 23 В этом исследовании мы повторно рассмотрели этот вопрос с использованием мышей Gli-CreER T2 и показали, что Cre, управляемый Gli1, специфически экспрессируется в виментин-положительных фибробластах, но не CD45-положительных лейкоцитах и CD31-положительные эндотелиальные клетки () после IRI.Таким образом, используя две модели (UUO и IRI) и разных мышей-репортеров (Gli1 LacZ и Gli-CreER T2 ), мы четко установили, что Shh, полученный из канальцев, избирательно нацеливается на интерстициальные фибробласты, что приводит к их пролиферации и активации. 22 Способность Shh стимулировать пролиферацию фибробластов весьма впечатляюща, о чем судили по подсчету клеток, анализу МТТ и оценке включения BrdU (), предполагая, что Shh, полученный из канальцев, может быть долгожданным мощным митогеном, который контролирует разрастание и разрастание фибробластов в прилегающем интерстиции.Хотя это не было проверено, существует вероятность того, что Shh также может влиять на выживаемость фибробластов. Идентификация Shh как фактора роста фибробластов также согласуется с появляющимися доказательствами того, что повреждение канальцев является ранним и основным событием в почечном фиброгенезе. 9 , 10 Таким образом, наши исследования установили, что Shh, растворимый фактор, происходящий из поврежденных канальцев, играет решающую роль в определении размера популяции фибробластов в пораженных почках, прежде всего опосредуя EMC.

Процесс перехода фибробластов в миофибробласты при фиброзе почек проявляется повышенной пролиферацией клеток, de novo ? Экспрессия -SMA, усиление продукции интерстициального матрикса и потеря способности продуцировать эритропоэтин. 1 , 4 , 37 Похоже, что Shh является полным фиброгенным митогеном, который не только способствует пролиферации фибробластов, но и индуцирует их миофибробластный переход, поскольку Shh способен индуцировать α -SMA, коллаген I, фибронектин и экспрессия десмина в культивируемых фибробластах, как сообщалось ранее. 22 Эти комбинированные эффекты Shh на пролиферацию фибробластов и фенотипический переход могут привести к резкому увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках. Однако, происходит ли Shh-индуцированная пролиферация фибробластов и их миофибробластическая активация параллельно или последовательно, еще предстоит определить. Более того, также неясно, опосредуются ли пролиферация фибробластов и фенотипический переход, контролируемые Shh, общими или отдельными внутриклеточными сигнальными путями.

Наиболее интересным открытием этого исследования является подтверждение решающей роли Shh в обеспечении пролиферации фибробластов и почечного фиброза in vivo . Используя подход, основанный на усилении или потере функции, мы показываем, что Shh способствует фиброзу почек во время перехода от ОПН к ХБП после травмы, и эта проблема все чаще признается в клинических исследованиях. 38 40 В соответствии с данными in vitro , сверхэкспрессия Shh с помощью гидродинамического подхода к доставке генов приводит к значительной экспрессии функционального Shh, что было показано с помощью мРНК Gli1 и индукции белка в почках (), и заметно ускоряет прогрессирование фиброзных поражений почек ().Мы решили манипулировать экспрессией Shh через 3 дня после IRI, потому что к этому моменту острая фаза повреждения и восстановления почек в этой модели почти завершена, о чем судят по уровню креатинина в сыворотке. 9 , 33 Соответственно, ингибирование передачи сигналов Shh ингибитором Smo CPN также избирательно блокирует пролиферацию интерстициальных фибробластов и уменьшает фиброз почек (и). Эти результаты однозначно показывают фундаментальную роль передачи сигналов Shh в контроле пролиферации фибробластов и почечного фиброза in vivo и предполагают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью низкомолекулярного ингибитора может быть вероятной стратегией терапевтического вмешательства при ХБП.

Таким образом, используя несколько моделей животных и биопсию почек человека, мы показали, что индукция Shh по канальцам является частой патологической находкой при большом разнообразии ХБП. Эти исследования также идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный митоген, который избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro и in vivo . Следовательно, Shh может быть долгожданным фибробласт-специфическим фактором роста из канальцев в поврежденных почках. Наши результаты также подтверждают принцип того, что блокада передачи сигналов Shh может быть новой стратегией терапевтического лечения почечного фиброза при ХБП.

Краткие методы

Животные модели

Самцов мышей BALB / c массой около 20-25 г были получены от Harlan Sprague – Dawley. Почечный IRI был выполнен на мышах BALB / c с использованием установленного протокола, как описано в другом месте. 41 Вкратце, двусторонние почечные ножки зажимали в течение 35 минут с помощью зажимов для микроаневризмы. Во время ишемического периода температура тела поддерживалась между 35 ° C и 37,5 ° C с помощью системы нагрева с регулируемой температурой. Через 3 дня после IRI мышей подвергали либо однократной внутривенной инъекции плазмиды экспрессии Shh (), либо ежедневным внутрибрюшинным инъекциям CPN (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури) в дозе 5 мг / кг массы тела в течение 7 дней (), как сообщалось ранее. 22 , 31 Мышей умерщвляли через 10 дней после IRI, и ткани почек собирали для различных анализов. Для модели нефропатии ADR самцам мышей BALB / c вводили ADR (гидрохлорид доксорубицина; Sigma-Aldrich) путем однократной внутривенной инъекции в дозе 10 мг / кг массы тела, как сообщалось ранее. 24 Мышей умерщвляли через 5 недель после инъекции ADR. Кроме того, модель остаточной почки была создана у самцов крыс Sprague-Dawley путем нефрэктомии 5/6, как описано в другом месте. 25 Почки собирали через 12 недель и подвергали различным анализам.

В отдельных экспериментах трансгенные мыши Gli1-CreER T2 , у которых рекомбиназа Cre находится под контролем эндогенных элементов промотора / энхансера Gli1, были получены из лаборатории Джексона (запас № 007913). 42 Мышам внутрибрюшинно вводили тамоксифен (T5648; Sigma-Aldrich) в дозе 25 мг / кг веса тела в течение 5 дней, а затем подвергали IRI, как описано выше.Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в Университете Питтсбурга.

Конструирование вектора экспрессии Shh и

In vivo Перенос гена

Плазмидный вектор, содержащий кДНК Shh человека, был получен от Addgene (pBS-hShh, # 13996). Вставку кДНК Shh высвобождали и субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих p3xFlag (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), используя рутинную методику молекулярного клонирования.Пустой вектор экспрессии pcDNA3 был приобретен у Invitrogen. Плазмидную ДНК вводили мышам с помощью метода переноса генов, основанного на гидродинамике, путем быстрой инъекции большого объема раствора ДНК через хвостовую вену, как описано в другом месте. 30 Вкратце, 20 мкг г плазмидной ДНК разводили в 1,8 мл физиологического раствора и вводили через хвостовую вену в кровоток мыши в течение 5-10 секунд. Мышам контрольной группы аналогичным образом вводили 20 мкг г пустого вектора pcDNA3.Плазмиды вводили через 3 дня после IRI, мышей умерщвляли через 10 дней () и собирали образцы ткани почек.

Образцы биопсии почек человека

Образцы почек человека были получены в результате диагностической биопсии почек, выполненной в больнице Нанфанг Южного медицинского университета. Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля. Залитые парафином срезы биопсии почек человека (2,5- мкм толщиной мкм) получали с использованием стандартной процедуры.Все исследования с участием срезов почек человека были одобрены институциональным наблюдательным советом Питтсбургского университета и институциональным этическим комитетом Южного медицинского университета.

Культура клеток

Клетки NRK-49F и mIMCD-3 были получены из Американской коллекции типовых культур. HKC-8 был предоставлен Л. Ракузеном (Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд). Клетки поддерживали, как описано ранее. 22 Клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3 с недостатком сыворотки обрабатывали рекомбинантным человеческим белком Shh (StemRD Inc., Burlingame, CA) в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. Затем клетки собирали и подвергали различным анализам.

Анализ пролиферации клеток

Пролиферацию клеток оценивали двумя способами: подсчетом клеток и анализом МТТ. Количество клеток подсчитывали с помощью гемацитометра. Клеточную пролиферацию также определяли количественно с помощью МТТ-анализа. Вкратце, клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 10 3 / лунку.После прикрепления клеток культуры заменяли бессывороточной средой и инкубировали в течение 24 часов с последующей обработкой Shh или без Shh в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. МТТ (5 мг / мл) добавляли к среде в количестве 10 мкл мкл / лунку с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 4 часов. После удаления среды клетки лизировали 100 мкл мкл диметилсульфоксида. Поглощение каждой лунки измеряли считывающим устройством для микропланшетов при длине волны 490 нм.

Анализ включения BrdU

Действие Shh на синтез ДНК фибробластов оценивали по включению BrdU. Вкратце, клетки высевали на 24-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 48 часов, а затем им пульсировали BrdU (10 мк M) в течение 24 часов. Клетки фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 20 минут, и ДНК денатурировали инкубацией с 2,5 н. HCl в течение 20 минут с последующей нейтрализацией 0,1 М борной кислотой. Активность эндогенной пероксидазы гасили путем инкубации клетки с 3% H 2 O 2 в PBS в течение 20 минут, а неспецифическое связывание блокировали путем инкубации клеток с 10% ослиной сывороткой в ​​течение 10 минут при комнатной температуре, как описано ранее. 7 Инкорпорированный BrdU был обнаружен с помощью мышиного моноклонального антитела против BrdU (B2531; Sigma-Aldrich) с последующей инкубацией с конъюгированным с цианином Cy3, аффинно очищенным вторичным антителом (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Окрашенные клетки помещали в среду для закрепления противоэпидальных эффектов Vectashield, используя SYTO-Green для визуализации ядер. Окрашенные образцы просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом Eclipse E600, оснащенным цифровой камерой (Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк).

qRT-PCR в реальном времени

Полную РНК экстрагировали с использованием системы выделения РНК TRIzol (Invitrogen). Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора для системы обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Madison, WI). qRT-PCR выполняли в системе определения последовательности ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), как описано ранее. 22 Последовательности пар праймеров для различных генов показаны в дополнительной таблице 2.ПЦР проводили в стандартных условиях. Уровни мРНК различных генов рассчитывали после нормализации с помощью β-актина.

Вестерн-блот-анализ

Ткани почек лизировали буфером для анализа радиоиммунопреципитации, содержащим 1% NP-40 тергитол-типа, 0,1% SDS, 100 мкг мкг / мл PMSF, 1% коктейль ингибиторов протеазы и 1% фосфатазы I и Смесь ингибиторов II (Sigma-Aldrich) в PBS на льду. Супернатанты собирали после центрифугирования при 13000 × g при 4 ° C в течение 15 минут.Экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее. 43 В качестве первичных использованных антител были использованы анти-Shh (sc-9024), анти-PDGFR- β (sc-432), анти-PCNA (sc-56) и анти-c-Myc (sc- 40s) от Santa Cruz Biotechnology, анти-Gli1 (AF3455) от R&D Systems, антифибронектин (F3648), анти- α -SMA (A2547), анти-десмин (D1033), анти-Flag (F4042) и анти- α -тубулин (T9026) от Sigma-Aldrich, анти-c-fos (PC05) от Calbiochem, анти-актин (MAB1501) от Chemicon и анти-GAPDH (# 2118s) от Cell Signaling Technology.

Гистология и иммуногистохимическое окрашивание

Залитые парафином срезы почек мыши (3- мкм толщиной мкм) получали обычным способом. Срезы окрашивали реагентами MTS по стандартному протоколу. Иммуногистохимическое окрашивание проводили согласно установленному протоколу, как описано ранее. 41 Антитела против Shh (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology), PDGFR- β (sc432; Santa Cruz Biotechnology), десмина (D1033; Sigma-Aldrich) и Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.) были использованы.

Коиммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

Криосрезы почек фиксировали 3,7% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре и погружали в 0,2% Triton X-100 на 10 минут. После блокирования 10% ослиной сывороткой в ​​PBS в течение 1 часа слайды были коиммуноокрашены следующими антителами: анти-Cre (MAB3120; EMD Millipore), анти-Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.), анти-ламинином (L8271; Sigma). -Aldrich), анти- α -SMA (A2547; Sigma-Aldrich), анти-CD45 (ab60291; Abcam, Inc.) и анти-CD31 (550274; BD Pharmingen). Для визуализации первичных антител слайды окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с цианином Cy2 или Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Окрашенные слайды просматривали под конфокальным микроскопом Leica TCS-SL, оснащенным цифровой камерой.

Статистический анализ

Все данные были выражены как средние значения ± SEM. Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения SigmaStat (Jandel Scientific Software, Сан-Рафаэль, Калифорния). Сравнение между группами проводилось с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Ньюмана-Кеулса. P <0,05 считалось значимым.

Содержание ежей — экзотических и лабораторных животных

Поскольку большинство ежей с готовностью принимают защитную позу (свертываются в плотный клубок), когда их берут на руки или удерживают, тщательное обследование требует химической сдержанности. Перед обращением за ежиком следует понаблюдать за ним в смотровой. Поверхностный осмотр может проводиться, пока еж перемещается внутри прозрачного контейнера (например, возможна оценка его брюшной полости), в его клетке или на столе для осмотра.Здоровые, не испытывающие стресса ежи, даже если поначалу стеснялись, должны быть активными, а со временем разворачиваться и пытаться исследовать окружающую их среду. Здоровые ежи обычно ходят с поднятым брюшком над землей, но слабые или настороженные ежи могут приседать. При исследовании ежи постоянно вылизывают обычно влажный нос. Дыхание обычно тихое, кроме случаев, когда ежик шипит или фыркает в защиту. Нормальный кал темно-коричневый и очень мягкий. В областях с шипами кожа может казаться слегка сухой или шелушащейся, но чрезмерное шелушение, выпадение иглы, эритема и образование корок являются ненормальными.

Остальную часть обследования можно проводить после того, как ежу введут сильные седативные препараты или анестезию. Гидратацию можно оценить по тургору кожи век и волос. Глаза должны быть чистыми, а края ушных раковин без корок или рваных краев. У африканских карликовых ежей маленькие (≤3 мм в диаметре) длинные горизонтальные слуховые проходы, что делает рутинное отоскопическое обследование трудным, а отоскопическое обследование барабанных перепонок — невозможным. Следует осмотреть полость рта и язык на предмет новообразований, признаков пародонтоза, переломов зубов, язв и инородных материалов.Зубы должны быть белыми, а десны — однородно-розовыми. Лимфатические узлы обычно трудно пальпировать, но лимфаденомегалия может проявляться неоплазией или инфекцией. Сердце должно иметь регулярный ритм и без шумов, а пульс на бедре должен прощупываться. Контур живота должен быть плоским, но может быть растянут из-за ожирения, органегалии, новообразований или жидкости.

У мужчин репродуктивного возраста большие семенные пузырьки могут быть ошибочно приняты за образование в брюшной полости, поскольку они простираются от входного отверстия таза к почкам и дорсальнее мочевого пузыря.Крайнюю плоть или вульву следует обследовать на предмет наличия воспаления, выделений или прилипшего мусора. Яички обычно пальпируются в параанальной области.

Цифры следует проверять на предмет опоясывающих волокон и заросших гвоздей.

12 странных, но распространенных форм поведения и фактов ежей

Быстро… Можете ли вы представить себе маленького питомца-млекопитающего, которого нужно правильно погладить, или вам, возможно, придется потянуться за повязкой? (И нет, это не имеет ничего общего с большим плохим укусом!) Если вы сказали «ёжик», вы правы.Самая выдающаяся особенность этого милого маленького существа — его иглы, которые, к сведению, не ядовиты, и они не оторвутся и не пристанут к вам, как иглы дикобраза. Ежик, безусловно, является интересным на вид домашним животным-компаньоном, и у него также есть интересное поведение.

1. Вы уронили перо?

У ежика иглы отрываются при определенных обстоятельствах. Подобно тому, как мы теряем молочные зубы, молодые ежи сбрасывают свои детские иглы, которые заменяются взрослыми.Кроме того, помните, что молодые ежи, как правило, сварливы, линяют перья, поэтому будьте особенно осторожны и осторожны при обращении с молодой живой изгородью. И аналогично представлению о том, что люди теряют волосы в условиях сильного стресса или во время болезни, взрослые ежи могут потерять иглы при аналогичных обстоятельствах.

2. Остановка, падение и откат

Hedgehogs по-новому используют распространенную фразу «Стой, падай и катись». Их защитная позиция заключается в том, что они скручивают свои тела в плотный клубок, когда они воспринимают угрозу, реальную или воображаемую.Эта поза направляет их иглы наружу, тем самым делая их более эффективными в отражении того, кто или что-то вторгается в их пространство. Это вполне можно считать последней стойкой, так как ежик может сначала попытаться убежать, прежде чем свернуться.

3. Копаем логово

В дикой природе ежи ищут укрытие в камнях и кустах или выкапывают себе красивое укрытие в земле. В домашних условиях ежику понравится место для копания, например ящик, заполненный материалом, который можно копать, например, полосками газеты или шерсти.Вы можете сделать его еще более заманчивым, добавив для него несколько закусок мучного червя.

4. Хафф и затяжка…

Ежик любит пыхтеть и пыхтеть, но он не пытается взорвать дом. Это обнюхивание — обычная вокализация, которую он издает, занимаясь своими исследованиями. Несчастный ежик, напротив, покажет свое презрение шипением или щелчком. Сделайте быстрый выпад, и вы станете свидетелем очень расстроенного ежа.

5. Мечтатель

Ежики от природы ведут ночной образ жизни, поэтому они, как правило, сонливы в течение дня и активны в вечерние часы. Уважайте часы сна вашего ежа, иначе он может упрекнуть вас в щелчках и выпадах, описанных выше.

6. Блокнот для холостяков (или холостяков)

Ежики, как правило, живут в одиночестве и обычно не любят делить свое пространство с другими ежами, а самцы особенно склонны к дракам. Некоторые энтузиасты ежей сообщают, что у двух самок больше шансов поладить, но между девушками тоже могут возникать драки.Будьте очень осторожны с любыми взаимодействиями между неизмененными самцами и самками, даже во время игры, поскольку они не являются сезонными заводчиками, и вы можете столкнуться с незапланированной беременностью.

7. Их любимое лакомство может вас заделать!

В отличие от многих других мелких млекопитающих-компаньонов, ежи находят жуков особенно вкусными. Хотя технически они классифицируются как всеядные, питаясь как растениями, так и животными в дикой природе, ежи также питаются такими насекомыми, как мучные черви и сверчки. В рамках своего основного рациона некоторые владельцы кормят своих домашних ежей кошачьим кормом, также доступны коммерческие рационы для ежей.

8. «Помазание себя»

Вот поведение, которое вы вряд ли встретите у других домашних питомцев: ежик, который находит особенно захватывающий новый запах, будет лизать его, пока во рту не образуется то, что лучше всего можно описать как ароматная пена. Затем он наносит эту пену на свои иглы языком, тем самым «помазывая» себя новоприобретенным ароматом.

9. Остерегайтесь гибернации

Говорят, что многие виды диких ежей впадают в спячку. Однако следует следить за температурой окружающей среды домашнего питомца, чтобы не вызывать спячку.Считается, что температуры ниже 68 градусов по Фаренгейту достаточно, чтобы отправить ежа в режим гибернации, который может проявляться как шаткая ходьба и снижение аппетита. Спящий режим может вызвать пневмонию или другие проблемы со здоровьем домашнего ежа, поэтому поддерживайте температуру в его комнате от 72 до 80 градусов по Фаренгейту.

10. Непростая ситуация

Ежики имеют обыкновение сунуть голову в трубки, такие как рулоны от туалетной бумаги, и контейнеры, такие как стаканчики для йогурта, и застревать их на голове.Фактически, в 2006 году McDonald’s в Соединенном Королевстве закончил разработку дизайна, удобного для ежей, с меньшим отверстием для десерта McFlurry после многочисленных сообщений о садовых ежах, которые находили выброшенные чашки и застревали в головах, вылизывая контейнеры. Некоторые любители домашних ежей сообщают, что их домашние животные, похоже, любят резвиться с трубкой или контейнером на башмаке, но это должно быть частью игры под присмотром взрослых. А разрезание по длине трубки дает ежу возможность освободиться.

11. Они жизнерадостны!

Ежики невероятно жизнерадостны — убедитесь сами, посмотрев одно из множества видеороликов на YouTube, где ежи легко плывут на спине, как чрезмерно надутый плот. Большинство из них, как правило, наслаждаются купанием в раковине или большой умывальнике, и, хотя они могут плавать и плавать, вам все равно нужно присматривать за ними во время купания.

12. Доказательство змеи?

Говорят, что у ежей есть естественный иммунитет против змеиного яда. Отнесите это к белку под названием эринацин, который присутствует в мышечной системе животного и обладает антигеморрагическими свойствами.(Нельзя сказать, что ваш ежик может сразиться с особенно смертоносной змеей, такой как гадюка или черная мамба!)

Хотите узнать больше? Выезд:


Автор: Лаура Деринг

Изображение функции: Коки Ямада / Shutterstock.com

Прямая потребность в передаче сигналов Hedgehog для нормальной спецификации всех вентральных доменов-предшественников в предполагаемом спинном мозге млекопитающих

  1. Марк Вейгерде1,2,3,
  2. Джилл А.МакМахон1,3,
  3. Майкл Рул1, и
  4. Эндрю П. МакМахон 1,4
  1. 1 Департамент молекулярной и клеточной биологии, Биолаборатории, Гарвардский университет, Кембридж, Массачусетс 02138, США

Аннотация

Сигнальный путь hedgehog организует развивающуюся вентральную нервную трубку, устанавливая разные судьбы нейральных предшественников. вдоль дорсовентральной оси. Smoothened ( Smo ) необходим для всей передачи сигналов Hedgehog (Hh), а генетическая инактивация клеток Smo автономно блокирует способность клеток передавать сигнал Hh. Используя химерный подход, мы исследовали поведение из Smo нулевых мутантных клеток-предшественников нейронов в развивающемся спинном мозге позвоночных, и мы показываем, что прямая передача сигналов Hh важна для спецификации всех вентральных популяций предшественников.Далее, передача сигналов Hh распространяется в дорсальную половину позвоночника. шнур, включая промежуточный домен экспрессии Dbx. Удивительно, но в отсутствие Sonic hedgehog (Шшш) мы наблюдаем наличие Smo-зависимой сигнальной активности Hh, действующей в вентральной половине спинного мозга, которая, скорее всего, отражает Индийский еж (Ihh) передает сигналы, исходящие из подлежащей энтодермы кишечника. Сравнительные исследования одиночных и сложных мутантов Shh , Smo и Gli3 показывают, что передача сигналов Hh частично определяет идентичность нервных клеток путем противодействия репрессивному действие Gli3 на образование p0, p1, p2 и pMN.Однако, в то время как эти клеточные идентичности восстанавливаются у составных мутантов Gli3 / Smo , правильная стратификация восстановленных типов вентральных клеток теряется. Таким образом, передача сигналов Hh важна для организации паттерн вентральных клеток, возможно, за счет контроля дифференциального сродства клеток.

Сноски

  • ↵2 Нынешний адрес: Департамент репродукции и развития, Erasmus MC, Erasmus University Rotterdam, P.О. а / я 1738, 3000DR, Роттердам, Нидерланды.

  • №3 Эти авторы внесли равный вклад в данную работу.

  • №4 Автор, ответственный за переписку.

  • ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА amcmahon {at} mcb.harvard.edu; ФАКС (617) 496-3763.

  • Статья и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1025702.

    • Поступила 22.07.2002 г.
    • Принята к печати 23 сентября 2002 г.
  • Лабораторный пресс Колд Спринг-Харбор

Лиганды Hedgehog (Hh) экспрессируются в эпителиальных клетках канальцев и …

Context 1

… http://ajp.amjpathol.org), как ожидалось. 3 экспрессия LacZ в Shh-GFPCre; Почки R26-LacZ были локализованы в собирательных протоках, положительных по аквапорину 2 (Рисунок 2A; см. Также Дополнительный Рисунок S4 на http://ajp.amjpathol.org). …

Контекст 2

… Гибридизация на месте в почках мышей P1 подтвердила окрашивание во внешнем мозговом веществе (рис. 1A), что согласуется с предыдущими результатами, полученными во время развития мышей. 3 Как и Shh, Ihh экспрессируется исключительно в эпителиальных клетках канальцев (Figure 2B). Большинство канальцевых клеток Ihh-nLacZ во внутренней коре и внешнем мозговом веществе окрашиваются совместно с проксимальным канальцевым маркером лектином Lotus tetragonolobus (рис. 2B; см. Также дополнительный рисунок S4 по адресу http: //ajp.amjpathol. …

Контекст 3

… Как и Shh, Ihh экспрессируется исключительно в эпителиальных клетках канальцев (Figure 2B).Большинство канальцевых клеток Ihh-nLacZ во внутренней коре и внешнем мозговом веществе окрашиваются совместно с проксимальным канальцевым маркером лектином Lotus tetragonolobus (рис. 2B; см. Также дополнительный рисунок S4 на сайте http: //ajp.amjpathol. Org), что согласуется с предыдущим отчетом экспрессии Ihh в рассеченных проксимальных канальцах с помощью ПЦР в реальном времени. …

Контекст 4

… исследования Ptch2 в срезах почки P1 соответствовали экспрессии Ptch2-nLacZ у взрослых мышей (рис. 1A) и эмбриональной почки. 20 Ptch2 также экспрессировался в отдельных эпителиальных клетках канальцев, клубочковых и эндотелиальных клетках в дополнение к интерстициальным клеткам (рис. 2С; см. Также дополнительный рисунок S6 по адресу http: // ajp.amjpathol.org). Напротив, Gli1 и Gli2 экспрессировались исключительно в интерстициальных клетках почек взрослого человека (Figure 2C). …

Контекст 5

… Ptch2 также экспрессировался в отдельных эпителиальных клетках канальцев, клубочковых и эндотелиальных клетках, в дополнение к интерстициальным клеткам (рис. 2С; см. Также дополнительный рисунок S6 по адресу http: //ajp.amjpathol.org). Напротив, Gli1 и Gli2 экспрессировались исключительно в интерстициальных клетках почек взрослого человека (Figure 2C). Хотя ранее сообщалось об экспрессии Gli1 в канальцах, особенно в условиях пониженного репрессора транскрипции Glis2, 21 мы не наблюдали окрашивания X-gal эпителиальных клеток канальцев с использованием нашей репортерной мыши Gli1-nLacZ, даже в почках от новорожденных и 7-дневных мышей (рис. 3А)….

Контекст 6

… тем не менее, наблюдал окрашивание X-gal эпителиальных клеток в зачатке мочеточника в нефрогенной зоне в почках новорожденных мышей Gli2-nLacZ, которое было снижено в почках с 7- у дневных мышей и почти полностью отсутствует в почках у 14-дневных мышей (рис. 3В). Наблюдалась более высокая плотность Ptch2, Gli1 и Gli2-положительных интерстициальных клеток, тесно связанных с сосудами (рис. 2C, три нижние панели). Количественные сравнения мРНК подтвердили, что Ptch2 и Gli2 были наиболее заметными ex- и interstitium (стрелки), тогда как экспрессия Gli1-nLacZ и Gli2-nLacZ ограничивалась интерстициальными клетками….

Пересечение внешних сигналов Hedgehog и WNT / Wingless с внутренним Hox-кодом лежит в основе схемы ветвления и разнообразия форм трубок в дыхательных путях дрозофилы

Образец цитирования: Matsuda R, Hosono C, Saigo K, Samakovlis C (2015 ) Пересечение внешних сигналов Hedgehog и WNT / Wingless с внутренним кодом Hox лежит в основе паттерна ветвления и разнообразия форм трубок в дыхательных путях Drosophila . PLoS Genet 11 (1): e1004929.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929

Редактор: Норберт Перримон, Гарвардская медицинская школа, Медицинский институт Говарда Хьюза, США

Поступила: 23.07.2014; Одобрена: 28 ноября 2014 г .; Опубликовано: 23 января 2015 г.

Авторские права: © 2015 Matsuda et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: Эта работа была поддержана Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии при KS, Шведским исследовательским советом при CS и Шведским онкологическим обществом при CS. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Разветвленные трубчатые сети, подобные нашей сосудистой сети, транспортируют и обменивают жизненно важные газы и питательные вещества вдоль целых организмов.Паттерны ветвления, трубчатые структуры и размеры в этих сетях демонстрируют значительные региональные различия, чтобы соответствовать различным потребностям органов-мишеней и гарантировать оптимальную функцию органов и приспособленность животных [1–4]. Адаптация морфологии ветвей к тканевой среде может быть достигнута путем изменения локальной доступности внешних факторов, таких как направляющие молекулы, и / или за счет внутренних региональных различий в способности клеток трубки отвечать и изменять результаты передачи сигналов. Хотя заметная роль вариаций внешних сигналов в органотипическом ветвлении становится широко установленной [3,5,6], внутренние механизмы трубки, определяющие дифференциальные ответы трубочных клеток на передачу сигналов, еще предстоит изучить [7-10].

Несмотря на огромную эволюционную дистанцию ​​насекомых и млекопитающих, формирование и созревание сети дыхательных труб у Drosophila melanogaster послужило плодотворной модельной системой морфогенеза ветвления [11,12]. Здесь мы используем эту систему для оценки вклада внутренней, регионально дифференцированной компетентности трубки в диверсификацию морфологии трубки.

Дыхательная сеть мух, также называемая трахеальной системой, широко разветвляется, доставляя кислород к каждой клетке тела (рис.1А) [13,14]. Он происходит из 10 первичных кластеров клеток, определенных в эктодермальных пара-сегментах (PS) 4-13 на каждой стороне тела [15]. На стадии 11 кластеры метамерных клеток инвагинируют и начинают расширять 6 первичных ветвей. Метамеры трахеи (Tr1-10) соединяются в сеть посредством активности от 5 до 6 специализированных клеток слияния в каждой ветвящейся единице [16-18]. Эти клетки находят и прикрепляются к своим ипсилатеральным или контралатеральным аналогам в соседних метамерах, образуя непрерывные трубки.

Рисунок 1. Онтогенетические и генетические различия между DTa1 и остальной частью DT.

Эмбрионы выровнены их передним левым и дорсальным верхом, если не указано иное.

(A), временной ряд развития дыхательных путей, визуализированный с помощью trh-lacZ . DTa1 отмечен стрелками. Справа показаны схемы типичных первичных ветвей или метамера 1/2. Подробности см. В тексте.

(B, C), эмбрионы поздней стадии 11, помеченные trh -LacZ и РНК in situ, гибридизация с salm (B) или kni (C).Обычно DT и DB инициируют экспрессию salm , тогда как экспрессия kni репрессирует salm позже в DB. Обратите внимание, что DTa1 (стрелки) экспрессирует kni , но не salm . (D, E) Контроль стадии 13 и эмбрионов Df (kni / knrl) , отмеченных kni- (dpp) -LacZ, Salm и Trh. Схемы их выражения показаны внизу.

В контроле (D) Salm обнаружен в DTp1-DT10. Salm также воспроизводимо обнаруживается в DB1 / 10 и TC1. kni- (dpp) -LacZ маркирует подмножества положительных ветвей Kni (DB / TC / GB), отвечающих на передачу сигналов dpp . kni- (dpp) -LacZ и Salm перекрываются только в DB1 / 10.

В Df (kni / knrl) (E) некоторые сегменты брюшной полости отсутствуют или срослись. Обратите внимание, что kni- (dpp) -LacZ-положительные клетки коэкспрессируют Salm в DB, ​​LT или GB (стрелка) и что целые концевые метамеры, предположительно Tr1 / 10, включая DTa1 (стрелка), экспрессируют Salm.

(F-K) Ветвление дыхательных путей, выявленное при экспрессии Gasp на стадии 15.DTa1 / CB отмечен стрелками или звездочками.

По сравнению с контролем (F), в Df (kni / knrl) (G), kni положительные ветви (DB, LT, GB, VB и DTa1) остановлены или отсутствуют. Ветви в Тр1 и Тр10 становятся очень толстыми. btl-gal4, , управляемый UAS-kni (H) или UAS-knrl (I), значительно снижает образование DTa1 / CB. btl-gal4 ведомый UAS-Axn-GFP (J) частично восстанавливает удлинение DB без влияния на дорсальное разгибание CB, в то время как btl-gal4 ведомый UAS-salm отменяет образование CB (K).Масштабные штанги: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.g001

Морфогенез ветвления трахеи контролируется двумя концептуально разными группами внешних сигналов [6,19]. Один требуется во всех основных ветвях, а другой класс определяет уникальные наборы основных ветвей. FGF / Branchless (Bnl) [20] динамически экспрессируется в окружающих тканях и служит общим внешним сигналом ветвления путем активации FGFR / Breathless (Btl) на клетках дыхательных путей [21-23].Активация Btl инициирует ориентированную миграцию клеток и усиливает удлинение ветвей, а также организует спецификацию клеточных судеб вдоль каждой первичной ветви. Постепенная спецификация отчетливого слияния и судьбы терминальных клеток на концах ветвей важна как для слияния ветвей, так и для дальнейшего ветвления ветвления [14,20].

Второй класс сигналов включает белки BMP, Wnts и Hh. BMP / Decapentaplegic (Dpp) экспрессируется в спинных и боковых полосах по длине эмбриона [24].Передача сигналов Dpp специфицирует и лицензирует дорсально (дорсальная ветвь, DB) и вентрально мигрирующие первичные ветви (латеральный ствол, LT и ганглионарная ветвь, GB), индуцируя экспрессию TF kni и knirps-related ( knrl ) в клетки дыхательных путей [24–26]. Wg экспрессируется в повторяющемся паттерне поперечных эктодермальных полос и вместе с др. Сигнальными молекулами WNT определяет идентичность дорсального ствола (DT) [27-29]. Он активирует экспрессию TF salm [30] в основных дыхательных путях сети. salm способствует образованию коротких и толстых трубок, подавляя интеркаляцию клеток, составляющих трубку [31,32]. С другой стороны, kni / knrl может репрессировать экспрессию salm в DB [25] и способствует интеркаляции клеток в длинных и узких трубках дорсальных (DB) и вентральных ветвей [31]. Hh также сегментарно экспрессируется в эктодермальных полосках и модулирует ветвление дыхательных путей, как косвенно, посредством позитивной регуляции экспрессии bnl [33], так и непосредственно посредством воздействия на спецификацию или удлинение терминальных клеток [34,35].Функции hh в первичном ветвлении еще предстоит тщательно изучить [34,36,37]. В совокупности дифференциальные идентичности первичных ветвей, устанавливаемые вторым классом внешних сигналов, тесно связаны с отличительными паттернами ветвления и размерами отдельных первичных ветвей [38].

Регион-специфическая модификация серийно гомологичных органов и отростков является общей темой в развитии животных [39–42]. Эволюционно консервативные комплексы генов Hox являются ключевыми селекторными генами тканевой идентичности вдоль передне-задней (A-P) оси животных [39,41,43-45] [46-50].В Drosophila , 2 группы Hox-генов, комплекс Antennapedia (ANTP-C) и комплекс Bithorax (BX-C) придают региональные различия строению тела посредством градуированной экспрессии их продуктов в соответствии с парасегментарными единицами [39, 51]. 3 гена, кодирующих белок BX-C [52], экспрессируются в отдельных и частично перекрывающихся доменах вдоль эмбриональной оси A-P. Экспрессия Ultrabithorax ( Ubx ) инициируется в клетках PS5, abdominal-A, ( abdA ), экспрессия начинается с PS7, а Abdominal-B ( AbdB ) — с PS10 [44,53].Связь между региональной модификацией морфологии дыхательных путей и Hox-генами была установлена ​​уже в ранних исследованиях мутантов Hox-гена. При потере всех генов BX-C метамеры трахеи Tr2-Tr10 трансформируются в Tr1 [39,54]. Однако генетические и молекулярные механизмы, устанавливающие различные морфологии ветвей вдоль дыхательных путей, в значительной степени не исследованы.

Здесь мы сосредотачиваемся на регуляции 2 различных морфологических модификаций вдоль основных дыхательных путей DT.Сначала мы анализируем, как самая передняя часть DT расходится по схеме разветвления и размеру трубки, чтобы образовались длинные и узкие трубки, нацеленные на голову. Мы показываем, что эти региональные модификации клеточного поведения контролируются комбинацией передачи сигналов hh и внутреннего Hox-кода дыхательных путей. Мы дополнительно исследуем механизм сужения трубки в центральной области дыхательных путей DT. Мы обнаружили, что гены BX-C модулируют градацию от переднего к заднему диаметру трубки DT частично посредством регуляции экспрессии уровня salm , мишени передачи сигналов WNT / wg .Наша работа подчеркивает, что внутренний Hox-код локально модифицирует результаты внешних сигналов, чтобы установить регионально разные паттерны ветвления и координировать формы трубок в соответствии с осью эмбриона.

Результаты и обсуждение

Специализированные схемы разветвления и формы трубок в Tr1

DT представляет собой непрерывную трубку, проходящую вдоль оси A-P эмбриона. Он соединяется с внешней средой через узкую трубку дыхальца в заднем дыхальце (PSP) [55].DT создается путем слияния передней (DTa) и задней (DTp) ветвей от каждого метамера трахеи (Tr1-Tr10) [13,17]. Дыхательные пути DT охватывают несколько региональных вариаций, которые обеспечивают подходящую систему для изучения взаимодействия внешней передачи сигналов с внутренними факторами во время морфогенеза трубки [13]. Во-первых, самый передний конец DT отходит на несколько специализированных ветвей (см. Ниже). Во-вторых, он показывает выраженное сужение диаметра от заднего к переднему, что контрастирует с цилиндрической формой других первичных ветвей сети.В-третьих, его самая передняя метамерная единица (Tr1) лишена слитой клетки DTa, тогда как самая задняя единица (Tr10) не генерирует слитую клетку в своей задней ветви (DTp).

В более общем плане, Tr1 отличается от остальных метамеров трахеи, потому что он включает в себя больше клеток и ветвей для насыщения кислородом специализированных органов головы и грудной клетки. Специализированные ветви Tr1 включают церебральную ветвь (CB), нацеленную на мозг, глоточную ветвь (PB) в переднюю часть кишечника, вентральную головную ветвь (VC), идущую до эпидермиса и мышц, и ганглионарную ветвь GB0, которая проникает в вентральный нерв. шнур.Среди них CB и VC напрямую связаны с передним концом дыхательных путей DT.

Несмотря на выраженные различия в паттернах конечного ветвления, ветвление в Tr1 сравнимо с обычным стереотипным первичным ветвлением Tr2-Tr9 во время стадии 11 (Fig. 1A). Однако на стадии 12 DTa1 удлиняется дальше, чем другие ответвления DTa, и смещается дорсально. На стадии 13 висцеральная ветвь 1 (VB1) и DTa1 совместно отделяются от поперечных соединительных элементов (TC). Позже DTa1 распространяется дорсально и кзади и поворачивается к мозгу, образуя CB [13].DTa1 / CB развивает очень узкие и длинные трубки по сравнению с толстыми и короткими ветвями DT в задних метамерах. VB1 распространяется больше кпереди, образуя глоточную ветвь (PB) (Fig. 1A).

Экспрессия kni в DTa1 / CB важна для образования CB

Постепенная морфологическая диверсификация CB / DTa1 по сравнению с ответвлениями DTa в др. Метамерах подтолкнула нас к исследованию экспрессии TFs идентичности ветвей, salm и kni . В «типичном» центральном метамере экспрессия salm активируется с помощью передачи сигналов wg / WNT [27-29] и выявляется в DB и DT на стадии 11 [30].Позже kni индуцируется в DB с помощью dpp , где он репрессирует экспрессию salm [24–26]. kni и salm коэкспрессируются в DB1 / 10 (см. Ниже). В отличие от DTa др. Метамеров, мы обнаружили, что экспрессия kni сильно активируется в DTa1 с поздней стадии 11 (Fig. 1B). Соответственно, salm не обнаруживается в DTa1 (Fig. 1C), хотя он становится активным в DTp1, как и в др. Метамерах (Fig. 1D) [30].

Чтобы проверить значимость дифференциальной экспрессии kni в DTa1, мы проанализировали мутанты, лишенные как kni , так и его паралога knrl .У этих мутантов с хромосомной недостаточностью брюшные сегменты отсутствуют из-за ранней функции гена gap ( kni ), тогда как развитие туловища является довольно нормальным [56]. В области ствола мутантов Df (kni / knrl) формирование положительных первичных ветвей kni [24,25] варьируется от полного отсутствия до срывания ветвей [25], в то время как у salm — положительные ветви DT могут образовываться и сливаться (см. ниже) [57]. Мы заметили, что у мутантов kni / knrl клетки дыхательных путей инициируют разрастание ветвей в дорсальном и вентральном направлениях и отвечают на dpp , индуцируя dpp -реагирующий репортер kni, kni- (dpp) -lacZ (рис. .1E). У этих эмбрионов salm эктопически обнаруживается в kni- (dpp) -lacZ положительных клетках в дорсальных или вентральных клетках рядом с полосой wg (Fig. 1E). Это указывает на то, что dpp опосредует индукцию kni / knrl , подавляет индукцию salm с помощью wg как в дорсальных [25,26], так и в вентральных ветвях. Однако в первом и последнем метамерах мутантов Df (kni / knrl) экспрессия salm дополнительно расширяется, чтобы покрыть почти весь метамер, включая предполагаемый CB / DTa1 (рис.1E). Это указывает на то, что kni функционирует в DTa1, чтобы репрессировать salm . Кроме того, способность трахеальных клеток индуцировать salm дифференциально модулируется в терминальных метамерах Tr1 и Tr10 по сравнению с центральными метамерами.

В соответствии с представлением о том, что общее снижение передачи сигналов wg / WNT может обходить потребность в передаче сигналов dpp / BMP во время удлинения DB в Tr2-Tr10 [31], btl -Gal4 [58] опосредовано сверхэкспрессией слитого GFP к Axin (Axn) [59–61], негативный регулятор передачи сигналов wg умеренно спасает дорсальное удлинение остаточных DB (DB1 и DB2) мутантов Df (kni / knrl) , но не спасает заметно расширение DTa1 / CB (рис.1J). Напротив, btl-gal4 , управляемые UAS-kni или UAS-knrl в мутантах Df (kni / knrl) , восстанавливают образование CB (рис. 1F-I). Таким образом, мы заключаем, что индукция kni и результирующая репрессия salm в DTa1 / CB важны для его образования и распространения. В подтверждение этого, btl-gal4 , управляемый UAS-salm на фоне дикого типа, значительно подавляет образование DTa1 / CB, но мало влияет на распространение DTa в Tr2-Tr10 [28,62], который эндогенно экспрессирует salm (рис.1К). В совокупности результаты подтверждают, что индукция kni и результирующая репрессия salm в DTa1 / CB важны для его образования и распространения.

hh необходимо для паттерна DTa1

Диверсифицированная экспрессия kni в DTa1 по сравнению с остальными ветвями DTa может регулироваться дифференциальной экспрессией экзогенных факторов управления вокруг DTa1 и / или внутренними различиями в компетентности клеток DT1.Во-первых, чтобы исследовать, какие внешние факторы находятся выше индукции kni в DTa1, мы проанализировали экспрессию или функцию известных секретируемых регуляторов ветвления дыхательных путей.

На стадии 11 Tr1, как и остальные метамеры трахеи, окружен 6 участками из bnl экспрессирующих клеток, что является прототипом стереотипных направлений общих первичных ветвей (S1A Fig.). Этот общий паттерн меняется в головной области эмбрионов на стадии 12, где DTa1 мигрирует к более дорсальному пятну экспрессии bnl (S1B, рис.). Несмотря на это различие, индукция kni в DTa1 все еще обнаруживается у мутантов btl (S1C, D фиг.), За исключением основной роли bnl в индукции kni в DTa1. dEGFR / слабый шарик / торпеда (вверху) [63] кодирует RTK, который, как предполагается, положительно действует на экспрессию salm [64] при связывании лиганда Spitz / EGF [65]. В эмбрионах, мутантных по ромбовидному (rho) , кодирующему протеазу, необходимую для генерации активного Spitz [66,67] или dEGFR , экспрессия kni в DTa1 / CB все еще происходит (S1E, F Инжир.). Это свидетельствует против роли локальной активации dEGFR в контроле экспрессии kni в DTa1.

dpp и wg являются известными индукторами kni / knrl в DB [24] и salm в DT [27,28], соответственно, в «типичном» метамере. Таким образом, вариации их экспрессии в близости Tr1 могут влиять на специализированные паттерны экспрессии kni или salm в DTa1. Однако экспрессия как dpp , так и wg сравнима с Tr1-3 (S1G, H рис.), оспаривая поучительную роль этих двух факторов в индукции kni в DTa1. Действительно, ни мутанты tkv , кодирующие одну из двух субъединиц рецептора dpp [68,69], ни мутанты arm , лишенные существенного компонента передачи сигналов wg [70-72], не показали серьезных дефектов в kni индукция и рост DTa1 / CB (S1I, J Рис.).

hh представляет собой сигнальную молекулу, которая связывает ее рецептор patched ( ptc ), тем самым снимая опосредованное ptc ингибирование 7 трансмембранного домена белка сглаженного ( smo ) [73,74]. hh экспрессируется полосами в эктодерме, примыкая к переднему краю зачатков дыхательных путей на стадии 10 и перекрывая переднюю часть инвагинированных клеток дыхательных путей каждого метамера на стадии 11 (S1K, L Рис.) [34]. Глейзер и Шило показали, что hh индуцирует экспрессию маркерных генов в передних мигрирующих ветвях центральных метамеров [34], утверждая, что передача сигналов hh формирует паттерны судьбы передних первичных ветвей «типичных» центральных метамеров. Мы обнаружили, что сразу после инвагинации примордиальных клеток дыхательных путей экспрессия ptc , транскрипционной мишени hh [75,76], активируется в предшественниках DTa1 (рис.2A), предполагая, что там активна передача сигналов hh . У мутантов hh дорсальное удлинение CB трудно обнаружить, а экспрессия salm расширяется во всем DT1 (Fig. 2B-D). Это указывает на то, что передача сигналов hh в DTa1 индуцирует kni и тем самым репрессирует экспрессию salm . Среди клеток, эктопически экспрессирующих salm в DTa1, некоторые клетки также экспрессируют kni , а другие нет. Мы предполагаем, что в отсутствие передачи сигналов hh , hh -ответная индукция kni теряется, в то время как передача сигналов dpp может вступать во владение, чтобы индуцировать экспрессию kni в некоторых положительных клетках salm .Такая эктопическая активация kni в отсутствие hh могла индуцировать эктопические kni / salm -двойные положительные клетки, напоминающие клетки DB1. Эта интерпретация согласуется с дерепрессией kni- (dpp) -lacZ у мутантов Df (kni / knrl) (Fig. 1E). Таким образом, мы заключаем, что передача сигналов hh необходима для индукции kni и репрессии salm в DTa1. Более ранняя функция hh также необходима для поддержания полосатой экспрессии wg [75,77], которая индуцирует экспрессию salm в DT.Таким образом, вариабельность экспрессии salm либо в DTa1, либо в DTa / DTp любого метамера у мутантов hh может частично отражать снижение или потерю эпидермальной экспрессии wg .

В мутантах hh утрачена экспрессия bnl , управляющая миграцией DB в центральных метамерах, но экспрессия bnl в окружающих клетках, направляющая CB, все еще обнаруживается на стадии 12 (S1M Fig.). Тем не менее дорсальное продолжение CB-подобной ветви не обнаруживается у мутантов hh на более поздних стадиях (S1N рис.). Чтобы более непосредственно обратиться к эффекту передачи сигналов hh в DTa1, мы попытались инактивировать его компоненты, особенно в дыхательных путях. Передача сигналов hh модифицирует транскрипционную активность cubitus interruptus ( ci ) [74]. В отсутствие hh Ci протеолитически процессируется и действует как репрессор [78], тогда как при активации пути hh передача сигналов, опосредованная smo , подавляет этот протеолиз и превращает Ci в активатор [78–80].Баланс потери репрессорной формы и генерации активаторной формы Ci определяет hh сигнальных выхода [79–81]. Мы создали эмбрионы, экспрессирующие доминантно-отрицательные формы ci, ci DN ( ci rep [82,83] и / или ci 75 [78,84]) исключительно в дыхательных путях и оценили уровни экспрессии kni- (dpp) -lacZ (маркер DB и LT / GB) [25] и salm-TSE-lacZ (репортер экспрессии salm ) [30] в метамере 1.Оба маркера эктопически индуцируются в DTa1 этих эмбрионов на стадии 13 (рис. 2E-H), хотя количество клеток в этой ветви существенно не изменилось (20 клеток, стандартное отклонение SD = 0,707 для 5 эмбрионов дикого типа на стадии 13 и 2). 19,2 клеток, SD = 0,447 для 5 btl X2> ci rep эмбрионов). Мы интерпретируем, что неполная инактивация передачи сигналов hh в дыхательных путях с помощью ci DN , частично трансформировала клетки DTa1 в DTp1.Эти клетки все еще получают достаточно Dpp для экспрессии kni- (dpp) -lacZ . Более слабые эффекты эмбрионов, экспрессирующих ci DN по сравнению с мутантами hh , могут отражать неэффективность Ci DN или задержанную опосредованную btl -Gal4 экспрессию [58] Ci DN , которая начинается немного позже, чем инициирование действия hh на DTa1. Кроме того, специфическая для дыхательных путей сверхэкспрессия Ci DN или общая инактивация hh у мутантов smo часто приводила к дефектам ко-сегрегации DTa1 / VB1 и неправильной маршрутизации CB на стадии 16 (рис.2I, J и S1O рис.). Сходный фенотип неправильной маршрутизации CB был описан у мутантов unplugged ( unpg ), кодирующих TF, экспрессируемый в CB [54]. В самом деле, экспрессия ловушки энхансера unpg в CB эмбрионов дикого типа теряется при сверхэкспрессии Ci DN (Fig. 2I, J).

В совокупности эти результаты идентифицируют избирательную, прямую роль передачи сигналов hh в индукции различных клеточных идентичностей DTa1 по сравнению с клетками остальных ветвей DT.

Рис. 2. hh передача сигналов в дыхательных путях необходима для развития DTa1.

(A) На стадии 11 Ptc сильно выявляется во всех инвагинированных зачатках дыхательных путей (стрелка), отмеченных trh -LacZ, с самой сильной экспрессией в передней части (стрелка).

(B-J) Влияние потери передачи сигналов hh на развитие DTa1. Стрелки обозначают DTa1. Сводка фенотипов показана на (B).

(C, D) Экспрессия Kni и Salm на стадии 13 в отношении развития дыхательных путей, визуализированная с помощью trh -LacZ.

В контроле (C) DTa1 экспрессирует Kni, но не Salm, тогда как у мутантов hh (D) остаток DTa1 часто экспрессирует Salm. Kni переменно обнаруживается в этих остатках DTa1.

(E-J) Эффекты btl-gal4 , опосредованная сверхэкспрессией ci DN , на экспрессию kni- (dpp) -lacZ и salm-TSE-lacZ . Клетки дыхательных путей обозначаются Trh или Hindsight (Hnt) [126].

В контроле (E, G) kni- (dpp) -LacZ (E) обнаруживается в DB, ​​LT и GB, а salm-TSE -LacZ (G) обнаруживается в DT, за исключением DTa1.

При сверхэкспрессии Ci DN с помощью btl -Gal4 (F, H), DTa1 / CB дополнительно становится положительным для соответствующих репортеров энхансеров. Звездочками отмечена экспрессия kni- (dpp) -LacZ, эктопически индуцированная в VB.

(I, J) Эмбрионы стадии 16, отмеченные знаком Gasp и unpg -LacZ. Части каждого изображения увеличены внизу. В контроле (I) CB образует несколько более тонкую ветвь по сравнению с DB1, и его кончики сильно выражают unpg -LacZ.Сверхэкспрессия Ci DN по-разному генерирует CB, напоминающие DB1 по паттернам ветвления, диаметру трубки или отсутствию экспрессии unpg -LacZ (J). Звездочкой отмечен неверно маршрутизированный CB / DTa1.

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.g002

hh сверхактивация пути превращает DB1 и DTp1 в DTa1-подобные ветви

Преобразование DTa1 в DTp1 / DB1 при ингибировании передачи сигналов hh предполагает, что его сверхактивация может быть достаточной для преобразования DTp1 / DB1 в DTa1.Чтобы проверить это, мы проанализировали мутантов ptc , у которых передача сигналов hh неправильно активирована из-за потери ptc -опосредованного ингибирования smo [73,74]. У мутантов ptc дорсальная часть метамера 1 экспрессирует Kni, но не Salm уже на поздней стадии 11 (Fig. 3A, B). Соответственно, на стадии 13 экспрессия salm-TSE-lacZ специфически теряется в метамере 1, что указывает на дефект как в спецификации DTp1, так и в спецификации DB1 (рис.3C и S3A Фиг., Обратите внимание, что у дикого типа salm () экспрессируется в DB1 и DTp1). В соответствии с потерей судьбы DB1 у мутантов ptc , экспрессия kni- (dpp) -lacZ в дорсальной части метамера 1 полностью потеряна (рис. 3E), в то время как белок Kni экспрессируется во всей дистальной части Tr1 (S2B рис.). Хотя мутанты ptc содержат меньше клеток дыхательных путей [33], предположительно из-за ранней активации wg [85], негативного регулятора размера зачатков дыхательных путей [86], уменьшения количества клеток у мутантов CycA [38] ] существенно не отменяет судьбы DB1 / DT1 (S2D, H Рис.). Это говорит о том, что влияние ptc на спецификацию DB1 / DT1 является более прямым и не связано с общим уменьшением количества клеток дыхательных путей. Поскольку btl -Gal4 управляемый Ci rep (рис. 3D, F) или Ci 75 может восстанавливать экспрессию как kni- (dpp) -lacZ , так и sal-TSE-lacZ в клетках Tr1. мутантов ptc и поскольку Ptc экспрессируется во всех зачатках дыхательных путей, включая весь зачаток Tr1 (фиг. 2A), эти результаты предполагают, что сверхактивация передачи сигналов hh в Tr1 отменяет судьбы DTp1 / DB1.

Для дальнейшего тестирования роли передачи сигналов hh в определении идентичностей ветвей в Tr1 мы проанализировали экспрессию РНК unpg . У контрольных эмбрионов на ранней стадии 12 экспрессия unpg сильно детектируется в DTa1 [54] и слабо в передней части TC1. Обе эти области соответствуют активации передачи сигналов hh (рис. 3G). На этапе 13 обнаруживается unpg РНК в CB и GB0 / GB1 в Tr1, а также в ГБ более задних метамеров Tr2-Tr9 (рис.3H) [54]. В соответствии с потерей экспрессии unpg-lacZ в CB при сверхэкспрессии Ci DN , unpg экспрессии РНК теряется в DTa1 / CB мутантов hh (фиг. 3K, L). Напротив, у мутантов ptc он расширяется кзади, чтобы покрывать положения DB1 / DTp1 / TC1 (Fig. 3I, J), указывая на их трансформацию в CB-подобные судьбы. В соответствии с расширенной экспрессией unpg , мы часто обнаруживали дупликацию CB-подобных ветвей у мутантов ptc (рис.3П). Мы дополнительно отметили, что экспрессия unpg в GB теряется у мутантов ptc (рис. 3J), в то время как unpg дерепрессируется в LTa у мутантов hh (рис. 3L), в соответствии с представлением о том, что hh придает идентичность передней ветви центральных метамеров [34].

На стадии 16 мутанты ptc обнаруживают вариабельные дефекты ветвления, включая остановленные GB, DB и разрывы DT [33]. Одновременно с потерей маркера судьбы DTp1 ( salm-TSE-lacZ ), DT1 и DT2 никогда не сливаются в мутантах ptc (рис.3Н-П). У дикого типа одна из клеток DTp1 принимает судьбу слитых клеток, активирует экспрессию dys и прикрепляется к слитой клетке в DTa2 (S2E рис.) [18]. У мутантов ptc , dys не активируется в DTp1, тогда как экспрессия dys вариабельно увеличивается в большем количестве клеток ветвей DT в задних метамерах (S2E-G рис.). Это может отражать увеличение эпидермальной экспрессии wg [85], индуктора судеб слитых клеток [27,28]. Неспособность активации dys и слияния DT1 в мутантах ptc в значительной степени компенсируется сверхэкспрессией Ci rep , опосредованной btl -Gal4 (S2I, рис.). Более того, как потеря экспрессии dys в DT1, так и дефекты слияния DT1 / 2 по-разному наблюдаются, когда доминирующий активный Ci, Ci act [84,87] сверхэкспрессируется в клетках дыхательных путей (S2J Рис.). Примечательно, однако, что сверхэкспрессия Ci act с помощью btl -Gal4 не уменьшала экспрессию salm-TSE-lacZ или kni- (dpp) -lacZ .

Итак, мы предполагаем, что передача сигналов hh инструктирует судьбу DTa1 за счет судеб DB1 / DTp1.В DTp1 передача сигналов hh д. Поддерживаться на низком уровне, чтобы сделать возможным правильный выбор судьбы слитых клеток и последующее слияние ветвей DT1 / DT2.

Рисунок 3. Избыточная активация сигнализации hh преобразует идентичности первичных ветвей в Tr1.

(A, B) Экспрессия Salm, Kni и Trh на поздней стадии 11. В отличие от контроля (A), где Salm активируется в DTp1 (стрелка), у мутантов ptc (B) повышенная регуляция Salm в DTp1 (стрелка) не обнаруживается, Kni занимает всю дистальную часть Tr1.Обратите внимание, что зачатки дыхательных путей выглядят меньше у мутантов ptc [33].

(C-F) Влияние мутаций ptc на экспрессию kni- (dpp) -lacZ и salm-TSE-lacZ . Клетки дыхательных путей обозначены Trh или Hnt.

По сравнению с контролем (рис. 2E, G) у мутантов ptc (C, E) экспрессия salm-TSE-lacZ (C) и kni- (dpp) -lacZ (E) теряется в дорсальной части Tr1 (звездочки). Сверхэкспрессия Ci DN с btl -Gal4 в мутантах ptc восстанавливает их экспрессию в Tr1 (D, F, стрелки).

(G-M) unpg Экспрессия РНК на стадии 12 (G, I, K) и стадии 13 (H, J, L) в отношении развития дыхательных путей, визуализированная с помощью trh-lacZ . Сводка фенотипов показана в (M).

(G, H) В контроле unpg РНК сильно детектируется в CB (стрелки) на стадиях 12 и 13. Экспрессия unpg также сильна в GB на стадии 13 (стрелка).

(I, J) В мутантах ptc экспрессия unpg расширена до DB1, DTp1 и TC1 (стрелки), в то время как ее экспрессия в GB практически не обнаруживается (звездочки).

(K, L) В мутантах hh , экспрессия unpg потеряна в CB (звездочка), тогда как она дерепрессирована в LTa в центральных метамерах (стрелки).

(N-P) Схема ветвления дыхательных путей, визуализированная Гаспом.

По сравнению с контролем (N), мутанты ptc (O, P) демонстрируют стойкую потерю слияния DT1 / 2 (звездочки). Кроме того, иногда происходит дублирование CB-подобных ветвей (P, стрелки).

Шкала линейки: 50 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1004929.g003

Абдоминальный шунт Hox-генов

hh передача сигналов от индукции kni в DTa

Индукция hh экспрессии kni в DTa эмбрионов дикого типа, а также потеря судьбы DT / DB у мутантов ptc ограничены Tr1. Однако ожидается, что исходы передачи сигналов hh будут одинаково значительными в более задних метамерах как дикого типа [34], так и ptc мутантных эмбрионов [33].Исключительное ограничение ответов Hh внутри Tr1 подразумевает наличие ингибиторного механизма, предотвращающего активацию kni в ветвях DTa задних метамеров. Гены BX-C представляют собой очевидные кандидаты в регуляторы идентичности задних метамеров и модуляторы исходов передачи сигналов hh вдоль оси A-P дыхательных путей. В самом деле, экспрессия unpg подавляется в прогрессивно более задних метамерах у мутантов Ubx и тройных мутантов Ubx abdA [54].

Экспрессия гена

BX-C градуирована по оси A-P метамеров дыхательных путей (S3A-D рис.). Экспрессия Ubx начинается в Tr2 (PS5) и достигает пика в Tr3 (PS6) (S3A фиг.). Экспрессия abdA начинается в Tr4 (PS7) и достигает пиков в Tr6 (PS9) (S3B фиг.), Тогда как экспрессия AbdB начинается в Tr7 (PS10) и достигает пиков в Tr10 (PS13) (S3C фиг.). Эти паттерны экспрессии согласуются с экспрессией генов BX-C в эктодерме [53], которая является источником зачатков дыхательных путей.

Чтобы изучить функцию генов BX-C в судьбах DTa, мы сначала наблюдали экспрессию dys в различных мутантах BX-C. В мутантах Ubx единичные слитые клетки обнаруживаются в Tr1, Tr2 и Tr3 (S3E, F фиг.), Что позволяет предположить, что DTa2 и 3 трансформируются в DTa1 / CB. Одиночные мутанты abdA не обнаруживают дефектов экспрессии dys в DT (рис. S3G), в то время как лишние клетки слияния в DTp10 обнаруживаются как в одиночных мутантах AbdB , так и в двойных мутантах abdA AbdB (S3H, I рис.). Это предполагает, что DT10, который обычно содержит только одну слитую клетку в своей ветви DTa, трансформируется в более переднюю идентичность. По сравнению с одиночными мутантами Ubx , двойные мутанты Ubx abdA имеют одиночные слитые клетки в Tr1-8 и часто в Tr9 (S3J Fig.). У тройных мутантов Ubx abdA AbdB DT-отрезки всех метамеров содержат одиночные слитые клетки (S3K рис.). Это означает, что ветви DTa в прогрессивно более задних метамерах трансформируются в DTa1 после прогрессирующей потери генов BX-C [39].Любого единственного гена BX-C достаточно, чтобы подавить судьбу DTa1. Соответственно, мы обнаружили увеличение экспрессии kni и потерю salm в трансформированном DTa в Ubx одиночных, Ubx abdA двойных и Ubx abdA AbdB тройных мутантах (фиг. 4A-C). Эти фенотипы часто сопровождаются появлением ответвляющихся дорсально ветвей, положительных для Kni, но отрицательных для kni- (dpp) -LacZ, Salm и salm-TSE -LacZ, напоминающих CB эмбрионов дикого типа (S3K Рис. .) [54]. Анализ экспрессии маркеров у мутантов BX-C предполагает, что в задних метамерах Ubx, abdA и AbdB мешают исходам передачи сигналов hh .

Если антагонистическая роль BX-C в индукции hh , опосредованной kni , отражает важную функцию BX-C в задних метамерах, можно ожидать некоторого восстановления дефектов ветвления мутантов BX-C при одновременной потере hh или kni / knrl .В самом деле, экспрессия salm де-репрессирована в DTa1-9 мутантов Ubx abdA hh и Ubx abdA kni / knrl (фиг. 4D, E). Кроме того, слияние DT слабо восстанавливается как у тройных, так и у четверных мутантов (S3L, M фиг.).

Вместе взятые, мы предполагаем, что гены BX-C противодействуют hh -опосредованной индукции kni в ветвях DTa.

Рис. 4. Внутренний код BX-C дыхательных путей определяет результат передачи сигналов hh .

(A-C) Влияние потери Ubx и abdA на судьбу DTa в центральных метамерах. У мутантов Df (Ubx abdA) на стадии 13 эктопическая миграция дорсального слова клеток, которые положительны для Kni и отрицательны для Salm, по-разному обнаруживаются в метамерах 1-7 (A). Эти трансформированные DTa / CB-подобные клетки (стрелки) отрицательны как для kni- (dpp) -lacZ (B), так и для salm-TSE-lacZ (C). Обратите внимание, что экспрессия Salm / salm-TSE -LacZ слабо обнаруживается в DB, ​​DTp и TC в трансформированных метамерах, а также в Tr1.

(D, E) Влияние мутаций hh или kni / knrl на экспрессию Salm в DTa мутантов Df (Ubx abdA) .

По сравнению с мутантами Df (Ubx abdA) (AC), с hh Df (Ubx abdA) (D) или с мутантами Df (kni / knrl) Df (Ubx abdA) , в которых функционирует ген раннего гэпа из kni спасено (E), экспрессия Salm одинаково обнаруживается в DTa и DTp. Отметим, что слияние DT-ветвей в центральных метамерах восстанавливается слабо (стрелки).Это спасение происходит не из-за искусственного коллапса зачатков дыхательных путей, потому что многие из внематочных отсеченных передних дыхательных путей (ASP) [125] (+, нижние панели) в проксимальной части дыхательных путей остаются отдельными.

(F-I) Влияние сверхэкспрессии генов BX-C на экспрессию Salm и Kni.

В контроле на стадии 13 (F) CB (стрелка) положительный для Kni и отрицательный для Salm. Обратите внимание на то, что экспрессия Salm при DT демонстрирует снижение в заднем направлении к переднему. При сверхэкспрессии Ubx (G), abdA (H) или AbdB (I), DTa1 становится отрицательным для Kni и положительным для Salm (звездочки).Обратите внимание на то, что снижение экспрессии Salm от задней к передней части в разной степени нарушается, наиболее заметно при сверхэкспрессии AbdB . Обратите внимание, что DB во всех метамерах сильно экспрессирует Salm при сверхэкспрессии AbdB .

(J) Краткое изложение состояний мутанта BX-C в отношении идентичности первичных ветвей.

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.g004

Специфическая для дыхательных путей экспрессия Hox-генов брюшной полости отклоняет передачу сигналов

hh от активации kni

Помимо дыхательных путей, гены BX-C экспрессируются во многих эмбриональных тканях.Куда они действуют, чтобы отклонить передачу сигналов hh от индукции kni в ветвях DT? В отсутствие реагентов для надежной условной инактивации генов BX-C в дыхательных путях мы отслеживали влияние специфической для дыхательных путей эктопической экспрессии генов BX-C на спецификацию клеток DT1. Первый метамер не экспрессирует гены BX-C (S3A-D рис.) И тем самым может обеспечивать наивную среду для оценки эффектов их сверхэкспрессии на активацию маркерных генов [41]. btl -Gal4, опосредованная сверхэкспрессией любого из генов BX-C на фоне дикого типа, неодинаково снижает экспрессию kni в DTa1 и одновременно приводит к увеличению уровней salm на стадии 13/14 (фиг.4F-J). На более поздних стадиях ветви DTa1 становятся толстыми, напоминая типичные ветви DTa задних метамеров (см. Ниже), что согласуется с ранее описанной потерей CBs при сверхэкспрессии abdA [88].

Аналогичным образом, btl -Gal4, опосредованная сверхэкспрессией либо Ubx , либо abdA , восстанавливает дефекты слияния DT1 и DT2 у мутантов ptc (S3N, O фиг.). Мы обнаружили, что экспрессия salm-TSE-lacZ и kni- (dpp) -lacZ восстанавливается в дорсальной части Tr1 мутантов ptc при сверхэкспрессии abdA (S3P, Q Рис.). Эти результаты доказывают, что Hox-код в клетках дыхательных путей автономно изменяет hh -сигнальные выходы в Tr1 как у мутантов ptc , так и у мутантов ptc , где путь hh гиперактивирован. Наконец, мы спросили, может ли трансгенная экспрессия abdA или Ubx в дыхательных путях восстановить дефекты слияния ветвей вдоль всего DT двойных мутантов Ubx abdA . Опять же, эта манипуляция спасает фенотип слияния ветвей (S3R-T рис.) утверждая, что гены BX-C автономно шунтируют передачу сигналов hh от индукции kni в ветвях DTa всех метамеров, чтобы способствовать непрерывному образованию DT.

Гены BX-C контролируют сужение трубки

Общей характеристикой биологических трубок является уменьшение диаметра трубок по их длине. У личинок Drosophila дыхательные пути получают воздух только от PSP и распределяют его вперед. Соответственно, трубки имеют сужение от задней части к передней [38], что предположительно постепенно увеличивает скорость потока к передней части и способствует диффузии воздуха от PSP к наиболее удаленным передним органам (http: // hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/pfric.html).

salm — главный селекторный ген для идентичности DT. Интересно, что уровни его экспрессии в трубках DT на стадии 13/14 обнаруживают в значительной степени пропорциональное снижение от задних к передним метамерам, соответствующее сужению дыхательных путей (Fig. 4F) [30]. Градиентный диаметр по длине дыхательных путей также совпадает со ступенчатой ​​экспрессией белков BX-C вдоль оси A-P. Чтобы изучить потенциальную регуляторную роль факторов BX-C и salm в формировании трубок, мы сначала проанализировали формы дыхательных путей у мутантов BX-C и обнаружили два типа эффектов генов BX-C на диаметр трубки: метамерно-автономный и системный ( см. ниже).

В соответствии с градуированной экспрессией AbdB в PS 10–13, у мутантов AbdB диаметр трубки в DT7-10 потерял сужение и стал более узким, что позволяет предположить, что количество AbdB пропорционально контролирует диаметр трубки. (Таблица Рис. 5A, C, I, J и S1). Точно так же у мутантов abdA градиент диаметра трубки в DT4-6 был потерян, а DT4-9 стал более узким (фиг. 5B, I, J и таблица S1), что снова указывает на то, что уровни AbdA пропорционально контролируют диаметр трубки DT.У двойных мутантов abdA AbdB форма дыхательных путей дополнительно изменена (фиг. 5D, I, J и таблица S1). Дыхательные пути Tr4-10 приобретают более цилиндрическую форму по сравнению с коническими трубками эмбрионов дикого типа. Мы предполагаем, что у эмбрионов дикого типа градиент активности abdA и AbdB будет накладываться на слабый, но четкий, не зависящий от abdA и AbdB градиент толщины трубки DT (рис. 5I и таблица S1). Это может объяснить, почему мутанты abdA , где ожидается преобразование PS7-9 (DT4-6) в PS6 (DT3), по-прежнему демонстрируют четкую разницу в диаметре трубок между DT3 и DT4, и почему мутанты AbdB , где PS10-13 (DT7-10), как ожидается, трансформируется в PS9 (DT6) покажет различный калибр трубки в DT6 и DT7 (рис.5I и таблица S1). Таким образом, в соответствии с их известными функциями в определении судьбы клеток и морфогенеза в эмбриональной эктодерме [39,44,53], гены BX-C автономно контролируют сужение дыхательных путей вдоль оси A-P. Отметим, однако, что существует также системный эффект мутаций BX-C на всем протяжении DT. У одинарных мутантов abdA, AbdB или двойных мутантов abdA AbdB диаметр более передних метамеров, где соответствующие гены BX-C не экспрессируются, также показывает небольшое уменьшение диаметра трубки (рис.5I и таблица S1). Среди различных возможностей, эти результаты могут указывать на то, что активность abdA или AbdB регулирует гидростатическое давление в просвете для неавтономного обеспечения пропорционального роста всех трубок DT [89] (см. Ниже). Остаточное сужение двойных мутантов abdA AbdB подразумевает механизм образования градиента от А до Р, независимый от abdA и AbdB. Ubx мог выполнять такую ​​функцию в отсутствие abdA и AbdB .Мы проанализировали мутанты bxd 113 или bxd 100 , у которых уровни экспрессии Ubx в PS5 становятся сходными с таковыми для PS4, но его эктодермальная экспрессия теряется начиная с PS7 [90] (S4A рис.). У этих эмбрионов диаметр трубки DT3 приближается к диаметру трубки DT2, и также наблюдается общее уменьшение диаметра трубки в более задних метамерах (рис. 5I, рис. S4C-E и таблица S1), что позволяет предположить, что эндогенный уровень Ubx контролирует диаметр трубки DT. расширение. Однако у двойных мутантов abdA AbdB уровни Ubx в основном одинаковы в DT4-10, что соответствует PS7-13 [91] (S5B рис.). Это предполагает наличие дополнительного, независимого от BX-C сигнала при формировании трубки DT. У тройных мутантов Ubx abdA AbdB , трансформированные Salm-положительные остаточные ветви DT / TC в задних метамерах немного толще, чем в передних метамерах, что еще раз доказывает существование постулируемого BX-C-независимого механизма формирования трубки (S3K, S4F Рис.).

Рис. 5. Гены BX-C контролируют сужение трубки DT.

(A-H) BX-C контроль сужения трубки DT, визуализированный с помощью просвета Gasp и апикального белка PTP10D.

В контроле (A) диаметр трубки DT сужается от заднего к переднему. У мутантов abdA диаметр трубки DT4-6 приближается к диаметру трубки DT3, тогда как у мутантов AbdB диаметр трубки DT7-10 напоминает диаметр трубки DT6. У двойных мутантов abdA AbdB диаметр трубки DT4-10 сходен с диаметром трубки DT3. Обратите внимание, что трубка все еще имеет слабое сужение.

При сверхэкспрессии Ubx (E) или abdA (F) диаметр трубки DT2 / 3 становится больше, чем у контроля.Мы заметили, что диаметр DT в задних метамерах резко уменьшается. Это может быть связано с конкуренцией между сверхэкспрессируемыми белками и эндогенными abdA или AbdB [46], что приводит к системному уменьшению диаметра трубки.

При сверхэкспрессии AbdB (G) слияние DT часто становится дефектным. Однако очевидно, что диаметр передних метамеров DT трубки похож на диаметр DT10.

При сверхэкспрессии salm (H) диаметр трубки DT становится больше, чем у контроля.Кроме того, увеличивается диаметр трубок других ветвей [28].

(I, J) Количественная оценка (I) и рисунки (J) фенотипов диаметра на этом и других рисунках показаны. Необработанные данные, используемые для количественной оценки, и некоторые статистические данные показаны в таблице S1. Подробности см. В тексте.

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.g005

Имеется ли какая-либо причинная связь между контролем экспансии DT, опосредованным BX-C, и постепенным увеличением уровня экспрессии salm в DT (рис.4F) [30]? Мы заметили, что уровни Salm снижены в центральных и задних метамерах двойных мутантов abdA, AbdB или abdA AbdB (S4G-J рис.). Это уменьшение в значительной степени согласуется с изменениями формы и диаметров трубок DT у соответствующих мутантов. Напротив, при сверхэкспрессии AbdB более высокие количества Salm обнаруживаются в DT всех метамеров на стадии 13 (фиг. 4I). Ветви DT этих эмбрионов часто останавливаются и не сливаются, что затрудняет оценку диаметра трубки.Тем не менее, диаметр DT во всех метамерах оказывается сопоставимым с диаметром самых задних ветвей DT (Рис. 5G). Избыточная экспрессия Ubx или abdA делает уровни экспрессии Salm однородными в передних метамерах (рис. 4G, H). Соответственно, диаметр DT в передних метамерах становится больше (рис. 5E, F, I, J и таблица S1).

Как градиент Салма вдоль оси DT A-P соотносится со ступенчатым расширением трубки DT? salm. Сверхэкспрессия придает идентичность DT другим первичным ветвям [28,62].Мы отметили, что сверхэкспрессия salm также обычно увеличивает диаметр трубки не только в трансформированных ветвях [28], но также и в DT, который эндогенно экспрессирует salm ( Fig. 5H, I, J and S1 Table). Запрограммированная секреция люминальных и апикальных белков была предложена для управления расширением трубок дыхательных путей Drosophila [92–95]. Тенектин (Tnc) представляет собой гликопротеин просвета, накапливающийся в DT и трубках задней кишки во время диаметрального расширения [96]. Сверхэкспрессия Tnc в дыхательных путях вызывает расширение трубки DT дозозависимым образом, потенциально за счет увеличения гидростатического давления [89], и уровни мРНК tnc увеличиваются характерным ступенчатым образом вдоль оси AP трубок DT у эмбрионов дикого типа [89] ].Мы обнаружили, что диаметральное увеличение, вызванное сверхэкспрессией salm в дыхательных путях, сопровождается увеличением уровней Tnc в просвете и, наоборот, Tnc становится неопределяемым в трахеальных трубках мутантов salm (S4K-M рис.). Это говорит о том, что Salm регулирует ступенчатые уровни экспрессии Tnc и, предположительно, других белков во время расширения пробирки.

Кроме того, увеличение диаметра ветвей salm над экспрессирующими эмбрионами все еще наиболее выражено в задних метамерах.(Рис. 5H, I, J и таблица S1). Акцентированное увеличение трубки в задних метамерах при сверхэкспрессии salm предполагает независимый режим контроля salm градиента от A к P диаметра трубки DT. Это согласуется с наблюдением, что диаметр трубок оставшихся ветвей у мутантов salm все еще самый толстый у Tr10 (S4N Fig.).

В заключение, наша работа предлагает два взаимозависимых механизма, с помощью которых внутренний Hox-код трубки контролирует идентичность ветвей и форму трубки в дыхательной сети Drosophila (рис.6А, Б). Во-первых, гены Hox автономно отклоняют внешнюю передачу сигналов hh от индукции kni в DT, тем самым создавая непрерывные salm положительных DT в дыхательных путях. Мы предполагаем, что это обеспечивает второй уровень регуляции формы DT трубки, где градиент Hox активности как локально, так и системно организует постепенное расширение трубки посредством salm зависимых и независимых режимов. Цепь Ci / BX-C может напрямую контролировать морфологию трубки путем связывания с регуляторными областями kni и salm , поскольку недавние исследования связывания TF в масштабе всего генома показывают, что kni является прямой мишенью ci [37 ] и что salm является прямой целью Ubx [97].В нашей модели сужение трубки и, следовательно, поток жидкости в просвете калибруются балансом между внешними сигналами и внутренним Hox-кодом. Так как гены селектора Hox регионально экспрессируются в др. Развивающихся трубчатых органах, таких как легкое млекопитающих [98] и сосудистая сеть [9,10], подобная регуляторная логика ветвления и формирования трубки может применяться к другим системам.

Рис. 6. Модели для BX-C зависимого управления схемами разветвления и диаметром трубки DT.

(A) Во всех метамерах экспрессия hh и wg в клетках, окружающих зачатки трахеи, сопоставима.В метамере 1, где отсутствует вход от BX-C, передача сигналов hh индуцирует kni в DTa1 у дикого типа и дополнительно в DTp1 у мутантов ptc . kni репрессирует опосредованную wg / WNT активацию salm , делая ветви DTa1 более тонкими. В задних метамерах BX-C шунтирует передачу сигналов hh от индукции kni , что делает возможной активацию salm с помощью wg / WNT . BX-C дополнительно усиливает экспрессию salm в DT.

(B) Гены BX-C координируют сужение от задней части к передней трубке посредством salm зависимых и независимых мод. Сужение трубки DT может также регулироваться независимо от генов BX-C посредством входных сигналов от материнских каскадов, каскадов генов гэпа или сегментации.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.g006

Материалы и методы

Генетика мух

Мух, содержащихся над балансирующими хромосомами [99], выращивали на стандартной среде.Соответствующие генотипы мы получили стандартными генетическими скрещиваниями. Для сверхэкспрессии генов мы использовали систему Gal4 / UAS [100]. Мутантные эмбрионы были идентифицированы по экспрессии конструкций twi-lacZ, ftz-lacZ, Ubx-lacZ или dfd-GFP [101], встроенных в балансирующие хромосомы. Мы идентифицировали мутанты, несущие мутации Ubx или AbdB , путем отбора эмбрионов с ранее описанными фенотипами в переднем дыхальце или PSP. Для сбора большого количества девственниц мы использовали Y-хромосому, несущую конструкцию hs-hid , разработанную R.Леманн и М. Ван Дорен [102]. См. Информацию о штаммах, описанных ниже, в Flybase [103].

Мутантные штаммы. abdA M1 (подарок Б. Гебелейна) [104], AbdB M1 , AbdB M5 и Df (3R) P115 as Df (Ubx ab584 AbdB Df (Ubx abdA AbdB ) I. Lohmann) [105], btl ∆oh20 и btl ∆oh34-1 [106], Df (5) as Df (salm / salr) (подарок М.Llimargas) [28,107], hh 13C [108], фрагмент раннего спасения kni; Df (3L) riXT (подарок Р. Шу) [25], rho d38 (подарок Д. Эндрю и А. Зальцберга) [109 110], rho 7M (подарок от J. Skeath) [111], top f24 (подарок К. Моисея) [112]. arm 4 и CycA 3 были получены из Национального института генетики (NIG), Мисима, Япония. Ubx 1 , abdA MX1 , abdA D24 AbdB D18 , Ubx 1 abdA D24 AbdB D18 [113], Df (109) как CycA C8LR1, Df (3L) Exel6115 as Df (CycA), hh AC , Df (3L) BSC448 гомозиготный или его трансгетерозигота более Df (3L) riXT as kn ptc 9 , Df (2R) Exel7098 as Df (ptc), smo 3 , tkv 7 и Df (2R) Exel6076 as Df (top) были получены из запаса Bloomington центр (BDSC), Индиана, США.

Штаммы-ловушки-энхансеры. 1-eve-1 as trh-lacZ (подарок от Н. Перримона) [114] и unpg r37 (подарок от FJ Diaz-Benjumea, R. Urbach и GM Technau) [115,116 ]. hh P30 [117] было получено из BDSC.

Штаммы репортерных энхансеров. kni- (dpp) -lacZ [25] и salm-TSE-lacZ [30] (подарки от R. Schuh).

Штаммы Gal4 и UAS. btl-gal4 на 2 хромосомах и 3 (подарок С. Хаяши) [58], UAS-abdA (подарок Ф.Дж. Диас-Бенджумеа) [115], UAS-ci 75 и UAS-ci h5P (подарки от С. Исии) [84], UAS-ci rep (подарок от А. Мура) [83], UAS-kni и UAS -knrl (подарки Р. Шу) [25]. UAS-AbdB, UAS-Axn-GFP, UAS-salm и UAS-Ubx были получены от BDSC.

Гибридизация и иммуноокрашивание in situ

Сбор яиц производился с помощью тарелки для яблочного / виноградного сока при 25 ° C. Эмбрионы отбеливали и фиксировали, как описано ранее [118], в течение 15–30 минут смесью 1: 1 гептана и фиксирующего раствора (3,7% формальдегида, 0,1 М Hepes pH 6,9, 2 мМ MgSO4). Эмбрионы подвергали дехорионированию метанолом и инкубировали в 0,1% PBT с добавлением 0,5% BSA. Постановка эмбрионов проводилась, как описано ранее [119].

Для иммуноокрашивания использовали следующие первичные антитела:

Анти-AbdA морской свинки (1: 500, подарок Б.Gebelein) [104], кроличьи анти-Dys (1: 500, подарок Л. Цзян) [18], анти-Gasp от морских свинок (1: 1000) [95], мышиные анти-Ubx (1:10, подарок Р. Уайта) [120], Anti-Kni для морских свинок (1: 300) (разработан Дж. Райницем и распространен Ю. Хироми, Восточноазиатский центр сегментирования антител, Мисима, Япония) [121], кроличьи анти-Salm (1: 200, подарки от R. Barrio и T. Cook) [107, 122], кроличьи анти-Tnc C-концевые (1: 1000, подарок ZA Syed и A. Uv) [89], крысы анти-Trh (1: 200, подарок Д. Эндрю) [123] и кроличий анти-Trh (1:50).Мышиные анти-Abd-B (1:10, предоставлены S. Celniker) [124], мышиные анти-Cut (1:10, предоставлены GM Rubin) [125], мышиные анти-Hnt (1:10, предоставлены HD Lipshitz) [126], мышиный mab2A12 (anti-Gasp) (1: 5, предоставлено M. Krasnow, N. Patel и C. Goodman) [17,95], мышиное анти-Ptc (1:10, предоставлено I. Guerrero) [127] и мышиные антитела к PTP10D (1:10, предоставлены K. Zinn) [128] были получены из банка гибридных исследований развития (DSHB), Айова, США. Коммерчески доступные антитела были анти-LacZ ( E.coli, .β-Галактозидаза) антитела козы (1: 500, Biogenesis) или кролика (1: 1000, Капель) и антитела против GFP кролика (1: 500, JL-8 Clontech), мыши (1: 1000, GFP20 Sigma) или козла (1: 500, ab6673 Abcam).

Осел или коза, меченные биотином или флуоресцентно меченные вторичные антитела, полученные против видов хозяев первичных антител, были приобретены в Jackson Laboratories. При необходимости использовали стрептавидин в сочетании с AMCA, FITC или Cy5. Для обнаружения mab2A12 использовали амплификацию TSA (PerkinElmer).

Двойное флуоресцентное мечение зондом РНК и антителом проводили, как описано [129]. Следующие клоны кДНК использовали для создания зондов для гибридизации; млрд (подарок М. Краснова) [20], dpp [108] и unpg (подарок П. А. Бичи) [54]. wg, salm и kni. клона были получены из Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), Индиана, США.

конфокальных изображений были получены с помощью Biorad MRC1024, Oympus Fluoview 1000 или Zeiss LSM780.Для сравнения использовали изображения контролей и мутантов, полученные с помощью одних и тех же конфокальных микроскопов. Изображения были обработаны ImageJ, а рисунки подготовлены в Photoshop и Illustrator.

Количественное определение Trh-положительного числа клеток CB было выполнено для эмбрионов стадии 13, окрашенных антителами против Trh и DE-cad, сканированных при 40-кратном увеличении с интервалом 0,6 мкм.

Для количественной оценки толщины трубки DT, 16 эмбрионов средней и поздней стадии, окрашенных антителами против PTP10D, Gasp и DE-cad, сканировали при 40-кратном увеличении с 0.Интервалы 6 мкм. Используя ImageJ, из каждого Z-образного изображения для каждого метамера были выбраны 3 точки рядом с основанием DB для измерения максимального расстояния между положительными апикальными мембранами PTP10D, перпендикулярными продольной оси трубки. Были измерены 3 эмбриона для каждого генотипа. Среднее значение, стандартное отклонение и p-значение t-критерия Стьюдента были рассчитаны с помощью Excel.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Выражение или потенциальные функции

dFGF / bnl, dEGFR, wg, dpp и hh для образования DTa1 / CB.

DTa1 отмечен стрелкой или звездочкой на разных панелях.

(A-D) млрд сигнализация.

(A, B) Выражение млрд .

(A) На поздней стадии 11, соответствующей 6 первичным ветвям дыхательных путей (обозначенным trh-lacZ ), 6 участков окружающих клеток экспрессируют млрд нуклеотидов для Tr1.

(B) На стадии 12, DTa1, по-видимому, распространяется в направлении экспрессии bnl , соответствующей позиции DB0.

(C, D) Экспрессия kni РНК.

По сравнению с контролем (C), у мутантов btl (D) на ранней стадии 12 индукция kni в DB варьируется, в то время как его экспрессия DTa1 сравнима. Различное увеличение использовалось для изображения одного и того же эмбриона на рис. 1B и S1C на рис.

.

(E-F) передача сигналов dEGFR .

У мутанта rho (E) или у мутанта dEGFR (F) экспрессия Kni в DTa1 / CB на стадиях 13–14 сопоставима с контролем (рис.1D).

(G-J) wg и dpp сигнализация.

wg Распределение РНК (G) относительно DT или dpp Экспрессия РНК (H) в дорсальных и боковых эктодермальных полосах на стадиях 11/12 сопоставима во всех метамерах.

(I) В плече мутантов на стадии 13 экспрессия Kni, а также как kni- (dpp) -LacZ в DB / LT / GB сопоставима с контролем (фиг. 1D).

(J) В мутантах tkv на стадии 13 экспрессия kni- (dpp) -LacZ в DB / LT / GB варьируется, в то время как экспрессия Kni в DTa1 / CB сравнима с контролем (рис.1D).

(К-О) хх сигнализация.

(K, L) Внешние (K) или внутренние (L) участки экспрессии Hh, отслеживаемые с помощью линии ловушки энхансера hh . hh обнаруживается чуть выше передней части зачатков инвагинированных дыхательных путей для всех метамеров (отмеченных Trh).

(M) В мутантах hh на стадии 12, экспрессия bnl , соответствующая удлинению DB, значительно снижена (кросс). Эктодермальные участки экспрессии bnl , соответствующие удлинению DT, становятся непрерывными.

(N, O) Gasp-положительное ветвление дыхательных путей у мутантов hh или smo .

(N) hh мутанты имеют различные дефекты, включая потерю или остановку ветвей (DB, DT, VB или CB) или потерю метамеров. CB не образует дорсального расширения. (O) мутанты smo часто обнаруживают фенотипы неправильной маршрутизации CB.

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.s001

(TIF)

S2 Рис. Эффекты сверхактивации передачи сигналов

hh на ветвление дыхательных путей.

(A-D) Влияние мутаций ptc или CycA на экспрессию kni или salm . Сводка фенотипов мутанта ptc показана на (C).

(A, B) В мутантах ptc / Df (ptc) экспрессия salm-TSE-lacZ (A) и kni- (dpp) -lacZ (B) теряется в дорсальной части метамер 1 (звездочки), тогда как белок Kni экспрессируется во всей дистальной части трахеи в Tr1 (B, нижняя панель).

(D) У мутантов CycA , у которых количество клеток в дыхательных путях снижено почти наполовину [38], DB во всех метамерах экспрессируют kni- (dpp) -lacZ соответственно (стрелки), и может происходить образование CB ( наконечники стрел).

(E-J) Эмбрионы стадии 14–15, окрашенные с помощью Gasp и Dys.

В контроле (E) точка слияния DT1 / 2 занята двумя клетками слияния, происходящими от DTp1 и DTa2 (стрелка).

В мутантах ptc (F, G) экспрессия dys не обнаруживается в положениях DT1p (и LT1p) (звездочки), тогда как мутантные эмбрионы CycA (H) сопоставимы с контролем (стрелка).

btl -Gal4 управляемый Ci rep (I) восстанавливает Dys-положительные слитые клетки в DTp1, а также слияние DT1 / 2 (стрелка).

Сверхэкспрессия Ci act с btl -Gal4 (J) может имитировать фенотипы мутантов ptc . Экспрессия Dys в позиции DTp1 теряется и сопровождается дефектами слияния DT1 / 2 (звездочка).

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.s002

(TIF)

S3 Рис. Экспрессия и функции Hox-генов BX-C в отношении развития дыхательных путей.

(A-D) Экспрессия генов BX-C на стадии 13, визуализированная соответствующими антителами.Сводка паттернов экспрессии показана на (D).

(A) Экспрессия Ubx начинается с метамера 2 и достигает пика в метамере 3. От метамера 3 до 10 экспрессия Ubx образует градиент.

(B) Экспрессия abdA начинается с метамера 4 и достигает пика в метамере 6. От метамера 7 до 10 экспрессия abdA образует градиент.

Только передняя половина метамера 10 экспрессирует Ubx и abdA .

(C) Экспрессия AbdB начинается в метамере 7 и достигает пика в метамере 10, образуя единый градиент.

(E-K) Фенотипы ветвления дыхательных путей мутантов BX-C, оцениваемые на стадии 15 с экспрессией Gasp, Dys и Cut.

В контроле (E) DT непрерывен с парой Dys-положительных слитых клеток в каждой точке слияния (стрелка для DT1 / 2). Концевые части дыхательного пути закупорены Cut положительными ASP и PSP (стрелки) [125].

В мутантах Ubx (E) метамеры 2/3 трансформируются в метамеры 1, о чем судят по потере слитых клеток в положении DTa (звездочки) и увеличению Cut-положительного ASP (отмечены знаком +).

В то время как мутанты abdA (F) в основном нормальны, как одиночные мутанты AbdB (H), так и двойные мутанты abdA AbdB (I) имеют эктопическую слитую клетку в DTp10 (звездочки), в дополнение к потере положительных по Cut PSP (крестики).

У мутантов Df (Ubx abdA) (J), помимо метамеров 2/3, метамеры 4–6 трансформируются в Tr1, тогда как трансформация вариабельна в Tr7-9. А именно, Dys-позитивные слитые клетки в положении DTa теряются в Tr2-8, тогда как Tr 9 имеет 1-2 слитых клетки.Часто наблюдается слияние DT9 / 10. Положительные эктопические ASPs выявляются в Tr2-9 (отмечены знаком +). Диаметр DTp в Tr7-10 выглядит толще по сравнению с более передними метамерами.

В тройных мутантах (K) Ubx abdA AbdB все метамеры трансформируются в Tr1. Отрезок положительный PSP утерян (крестик). Вместо этого Cut-положительный ASP (+), а также потеря судьбы слитых клеток в положении DTa (звездочки) наблюдаются во всех метамерах. Отметим, что у мутантов Ubx, Df (Ubx abdA) и Ubx abdA AbdB CB-подобные ветви в трансформированных метамерах по-разному обнаруживаются [54].

(L, M) Влияние мутаций hh или kni / knrl на DT мутантов Df (Ubx abdA) .

В мутантах hh Df (Ubx abd) (L) или в мутантах Df (kni / knrl) Df (Ubx abdA) слияние DT частично восстанавливается (стрелки). Обратите внимание, что это спасение происходит не из-за слияния зачатков дыхательных путей, потому что многие из внематочных Cut-положительных ASP в проксимальной части дыхательных путей являются отдельными.

(N-Q) Эффекты сверхэкспрессии Ubx или abdA на мутантных фенолипах ptc в Tr1.

По сравнению с мутантами ptc (рис. S2), эктопическое поступление Ubx (N) или abdA (O) в клетки дыхательных путей значительно восстанавливает судьбы как гибридных клеток в DTa1, так и последующее слияние DT1 / 2 (стрелки) . Точно так же сверхэкспрессия abdA в мутантах ptc восстанавливает экспрессию kni- (dpp) -lacZ (P) и salm-TSE-lacZ (Q) в метамере 1.

(R-T) Эффекты сверхэкспрессии Ubx или abdA на ветвление дыхательных путей двойных мутантов Ubx abdA .

В Df (Ubx abdA) / Df (Ubx abdA AbdB) transheterozyogote (R) Cut-положительные ASP обнаруживаются в метамерах 1–9. Причем частое слияние DT происходит только у DT9 / 10. Специфичная для дыхательных путей сверхэкспрессия Ubx (S) или abdA (T) частично восстанавливает слияние DT (стрелки). Обратите внимание, что bnl, ответвления, направляющие экспрессию DT, интактны в отсутствие комплекса BX-C [130].

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.s003

(TIF)

S4 Рис.

salm зависимая и независимая сужение дыхательной трубки с помощью BX-C и потенциальная цель salm для сужения трубки.

(A-C, F) Сужение трубы DT, визуализированное Гаспом и PTP10D.

По сравнению с контролем (A), где DT3 немного толще, чем DT2, у мутантов bxd 100 (B) или bxd 113 (C), DT3 становится сопоставимым или немного уже, чем DT2. У тройных мутантов BX-C (F) задние метамеры имеют тенденцию показывать немного более толстые трубки DT (стрелки).

(D, E) Экспрессия Ubx у мутантов BX-C на стадии 13/14.

В мутантах bxd 113 (D) экспрессия Ubx в DT3 становится сопоставимой с уровнем в DT2, тогда как у двойных мутантов abdA AbdB экспрессия Ubx в DT4-10 становится сопоставимой с уровнем в DT3.

(G-J) Влияние мутаций abdA и / или AbdB на экспрессию Salm в DT.

В контроле (G) уровень экспрессии Salm формирует градиент от заднего к переднему.У мутантов abdA (H) экспрессия Salm в центральных метамерах становится сопоставимой с более передними метамерами, тогда как у мутантов AbdB (I) экспрессия Salm в задних метамерах становится сопоставимой с центральными метамерами. У двойных мутантов abdA AbdB (J) градиент Salm становится более плоским, но слабый градиент все же обнаруживается.

(K-M) Влияние salm на экспрессию Tnc в DT.

В контроле (K) на стадии 16 Tnc секретируется в просвет, но локально обнаруживается в DT и TC1, оба из которых экспрессируют salm .Выражение Tnc и Salm в точках слияния несколько сильнее. Обратите внимание, что Tnc также экспрессируется в задней кишке и проксимальной части PSP. При сверхэкспрессии salm (L) Tnc обнаруживается в просветах дополнительных ответвлений, таких как TC (стрелка). В мутантах Df ( salm / salr ), где удалены как salm , так и соседний spalt-родственный ( salr ), экспрессия Tnc в дыхательных путях потеряна (M, звездочка), хотя его экспрессия в PSP и задняя кишка остается.

(N) У мутантов Df (salm / salr) ветви TC в задних метамерах толще, чем в передних.

Шкала линейки: 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.s004

(TIF)

S1 Таблица. Толщина DT мутантов различного диаметра трубок.

Генотипы есть; Дикий тип = Canton S, bxd = bxd 113 , abdA = abdA MX , AbdB = AbdB M1 / AbdB M1 / AbdB = abdA D24 AbdB D18 .

Таблица A. Исходные данные толщины DT в микрометрах. Для каждого генотипа у 3 эмбрионов измеряли толщину DT. Были измерены 3 точки каждого DT у основания DB.

Таблица B. Статистика необработанных данных. Средняя толщина, стандартное отклонение (SD) и p-значение t-критерия Стьюдента показаны для каждого DT. Для значения p показано сравнение между WT и каждым мутантом. Для одинарных мутантов wt, bxd, ​​abdA, AbdB или двойных мутантов AbdA AbdB показано дополнительное сравнение между различными метамерами или между мутантами.p <0,05 считается значимым.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004929.s005

(XLSX)

Благодарности

Мы благодарим членов сообщества мух, которые выделили, охарактеризовали или распространили штаммы, антитела или клоны ДНК мух. Мы особенно благодарим Д. Эндрю, Р. Баррио, Ф. Дж. Диас-Бенджумеа, П. Бичи, Т. Кука, Б. Гебелейн, С. Хаяши, Ю. Хироми, С. Исии, Л. Цзян, М. Краснов, М. Ллимаргас, И. Ломанн, А. Мур, К. Моисей, Н. Перримон, А.Salzberg, R. Schuh, Z., J. Skeath, A. Syed, GM Technau, R. Ueda, R. Urbach, A. UV, R. White, BDSC, DGRC, DSHB и NIG для прямого обмена штаммами мух, антителами или клоны ДНК. Мы благодарим M. Yamazaki за советы по штамму virginizer и Flybase для геномных ресурсов Drosophila . Мы благодарим Центр визуализации Стокгольмского университета и сотрудников лабораторий Маннервика, Сайго, Самаковлиса и Острёма за поддержку в ходе проекта, особенно М. Бьорка за обслуживание мух и В. Царухаса за постоянную поддержку.Особая благодарность Я. Эмори и Ф. Уи-Тей за помощь в поддержании штаммов мух после выхода на пенсию К.С.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.