Березка из бисера мастер класс пошаговое фото: Весенняя березка из бисера | Сделай сам своими руками

Весенняя березка из бисера | Сделай сам своими руками

Символом весны и красоты является березка. Она очень изящная, красивая и полезная. Почему бы не завестись такой красотой дома? Чаще всего, рукодельницы начинают свою работу именно с этого дерева. Сегодня я вам покажу несложный мастер класс по ее изготовлению. Высотой она получиться примерно 20 сантиметров.

Для веток, нам понадобиться два оттенка чешского бисера:
Темно-зеленый – 25 гр;
ярко-зеленый – 10 гр;
Проволока (коричневая) 0,03 – 1 катушка;
Нитки;
Проволока толстая (для формирования веток и ствола) – 2 штуки по 25 сантиметров.
Фиолетовый крупный бисер (для цветка) – 1 пакетик;
Розовый бисер – 5 гр;
Гипс – 400 гр;
Краска коричневая;
Краска белая;
Лак черный;
Бусины для украшения.

Для начала отрезаем проволоку для ветки, примерно 60 см. Набираем три бисеринки темно- зеленого оттенка, затем одну яркую и снова три темного.

Ведем бисер на середину проволоки и прокручиваем 2-3 раза, делая петельку.

Отступая где то по 1 см, делаем еще 5 таких петелек.

И так же само с другой стороны. Всего должно получиться 11 петелек.

Теперь складываем проволоку пополам на шестой петельки и начинаем перекручивать ветку.

Вот, у нас получилась одна веточка. Для верхушки березки мы делаем все точно так же, но всего 7 петелек, на 4 скручиваем пополам.

К первой толстой проволоки прикрепляем еще одну, формирую ствол. Берем 8 веточек (по 7 петелек) на каждый ствол и все вместе перекручиваем их. Затем на толстую проволоку накручиваем нашу верхушку. И так же на другой ствол.
Далее 3 веточки по 11 петелек скручиваем в одну. Таких пар понадобиться примерно штук 13. Чем больше, тем березка будет пушистей. Накручиваем ветки на толстую проволоку и закрепляем нитками.

Сейчас мы сделаем цветок из фиолетового бисера. Отрежьте 25 см проволоки. Плетем параллельным способом.

Делаем семь лепесточков. Для стержня отрежьте проволоки 15 сантиметров. Наберите 30 розовых бисерин и перекрутите спиралькой.

Вот такой цветочек у нас получиться.

Подберите емкость для дна березки. Постелите сверху полиэтиленовый пакет. Разведите 200 грамм гипса водой. Вылейте смесь в емкость, а сверху поставьте ровно березку. Сразу воткните фиолетовый цветок. За ночь гипс застынет. После чего обмажьте ствол березки раствором, с помощью кисточки. Снова ждем ночь для полного высыхания.

После чего наносим на ствол белую краску. Дать высохнуть часа три. Нижнюю часть прокрасьте коричневой краской.

В конце наносим черным лаком штрихи. Березка готова!

Бисероплетение схемы,мастер-классы. Деревья из бисера,цветы,украшения

Добро пожаловать на сайт IZ-BISERA.RU , который посвящен теме бисероплетение и все, что связано с бисером, на котором вы сможете найти мастер-классы, видеоуроки, схемы, много фото и видео, которые помогут вам разобраться с этой темой, научит вас делать красивейшие изделия из этого материала или, если вы уже умеете плести из бисера, возможно найдете что-то для себя новое, раздвинете горизонты своих навыков и опыта и станете более профессиональными в этом виде хобби или, возможно, уже видом заработка для вас, ведь иногда люди желают купить бисер, ленту для бисера, чтобы сделать самому что-то красивое, а некоторые люди желают просто купить бисерное дерево или ожерелье на подарок, так как у них нет времени или вдохновения делать самому.

Не секрет, что иногда хобби перерастает в что-то большее и это хобби, например бисероплетение, начитает приносить деньги, есть желающие купить и цена хорошая для них – то почему бы и нет. Сколько стоит бисерное дерево или другие изделия из бисера, вы найдете в интернете. Но также, хочется отметить, что многие не могут продать свое произведение искусства, так как то время и та часть души которая вложена при работе, уже не дает вам право продавать и многие просто дарят своим родственникам, близким и друзьям и начинают новую работу и с каждым разом получается все более красивее и профессиональнее или просто переключаются на что-то новое для себя. Например, научившись делать деревья из бисера, переходят на цветы или браслеты, ожерелья, серьги и так далее.

Потому если есть желание заработать, читайте материал, смотрите мастер-классы, видеоуроки и схемы, начинайте оттачивать мастерства и, когда будете чувствовать, что вы уже на высоком уровне, узнавайте сколько стоят бисерные деревья, украшения и другие изделия из бисера, ищите покупателя и если ваша цена будет оптимальной, то у вас будет первый покупатель. Возможно у нас на сайте будет раздел по продаже бисерных изделий для наших посетителей.

Если вас привлекает бисероплетение, но у вас слабый интернет или не всегда есть доступ в него – тогда вы сможете скачать схемы, видео и фото к себе на компьютер с нашего сайта, для этого создан отдельный раздел. Также видеоуроки можно как скачать, так и посмотреть онлайн.

Определение бисера и бисероплетения. Интересные факты.

Бисер или, второе название, бусины – небольшие объекты декоративной формы и с отверстиями для нанизывания на проволоку, леску или нитку.
Бусина используется во многих этнических изделиях и украшениях, это всем известные бусы, четки, браслеты, колье, цепочки и много другое. Материал из которого делают бусины может быть как дерево, так и янтарь и много других разных природных материалов. Особенно популярным материалом стало стекло и бусина может быть как из цельного стекла, так и пустотелая, которую часто заливали воском, дабы придать вид жемчуга. В современности используют полимерные материалы.

Бисерины могут иметь размер от доли миллиметра до нескольких сантиметров. Самые распространенные материалы из которых делают бисерины это пластик, стекло и камень, но на этом список не заканчивается. Материалом может послужить жемчуг, кости, металл, раковины моллюсков, драгоценные камни, бивни, керамика, ракушки, янтарь (смола деревьев, которая окаменела) и много разных других материалов которые знает и использовало и использует человечество.
Бисероплетение – это процесс изготовления украшений и других изделий из бисера, таких, как например вышивка и мозаика.

История появления бисера и от куда пришло название и что обозначает!?

Теперь поговорим о самой истории бисера. История бисера началась со времен возникновения стеклоделия. Одна из легенд гласит нам о том, что в очень далекие времена финикийские купцы везли природную соду добытую в Африке, и остановившись на ночлег, развели костер, но поблизости не было камней, чтобы его обложить камнями и пришлось это сделать с помощью кусков соды.

На утро разгребая костер, купцы обнаружили нечто блестящее и твердое как камень. Подняв, они обнаружили чистейшее прозрачное стекло переливающееся в лучах солнца. Это было первое стекло полученное случайным способом. С тех пор и началось исследование и освоение стеклоделия.
Легенда легендой, а история науки связывает появление стекла с Египтом. Именно там были обнаружены стеклянные плитки в пирамиде Джессера созданной в 3 веке до нашей эры. Также были обнаружены стеклянные украшения относящиеся к временам первой династии фараонов, а это еще более старший период – 5 век до нашей эры.
Месопотамии была обнаружена печать цилиндрической формы из прозрачного стекла, возраст 4 с половиной тысяч лет назад и она считается одним из первых образцов бусины, находится она в Берлинском музее.

Вот вам и бисер который появился почти шесть тысяч лет назад и в диаметре был 9 миллиметров. Конечно, со временем технологии совершенствовались и диаметр уменьшался и был найден способ делать отверстия в бусине.

Название и само слово бисер пошло от названия «фальшивый жемчуг». Изготовляли его в том же Египте из мутного стекла и по арабски называется «бусра» или «бусер».

Вот и все, теперь когда вы будете делать бисерные деревья, цветы, бусы, колье или что угодно из всеми нами любимого бисера, вы будете знать не только когда он появился, при каких обстоятельствах и где, но также и что обозначает само слово бисер. Ведь по сути многие слова заимствованы из других культур и языков. И иногда задумаешься и думаешь, а где же наши коренные слова? Кроме нецензурных конечно. Дело в том, что наш коренной язык был и он был очень уникален, но был период когда принудительно нам был навязан современный язык, дабы исказить нашу с вами историю, историю наших предков. Но это совсем другой вопрос.

Бисерные деревья и ваша фантазия. Какие деревья из бисера вам больше нравятся? Все виды деревьев, которые можно сделать самому!

На самом деле, хоть и мы и пишем в заголовке, все виды бисерных деревьев, на самом деле, скорее всего, никто не даст вам весь список, потому что при желании, можно найти схемы, или, составить ее самому, любого дерева которое есть в природе и даже больше того, придумать свое собственное уникальное, если угодно, сказочное. Включаем фантазию, черпаем от куда-то вдохновение и все в наших руках
Как бы то ни было, мы собрали самые популярные бисерные деревья и, захотев сделать что-то новое, вы сразу сможете зайти на сайт iz-bisera.ru и определиться с выбором.

Итак, переходим к делу.
Перечисляем все возможные деревья из бисера: Береза (или березка, как чаще говорят), рябина (также красная или снежная рябина), сакура, денежное дерево, дикий виноград, пальма, елочка из бисера (очень актуально на Новый Год, также есть елочка с украшениями и с шишками), сосновая веточка (раз речь пошла о хвойных деревьях), мирт, декоративная яблоня из бисера, дерево счастья,апельсиновое дерево.

Конечно же это не все типы, но наиболее популярные и мы постараемся по каждому дереву сделать схемы, мастер-классы, опубликовать побольше фото и даже сделать видео и даже дать возможность скачать к себе на компьютер.

Березка из бисера, мастер-класс, фото и схемы бесплатно

Очень часто популярное дерево для изделия из бисера – это береза. Как сделать березку из бисера бесплатно вы найдете в этой статье – Березка из бисера мастеркласс.
В статье будет подробнейшее описание и много фотографий, прочитав все, у вас не будет вопросов, а если и возникнут, то вы всегда сможете их создать.
Мастеркасс разбит на части, на такие, как создание веточек, как сделать ствол для дерева из бисера березы и конечно же подставка.

Для того, чтобы посмотреть, как сделать березку,
перейдите по ссылке – Деревья из бисера мастер-класс Березка
Также будут представлен список всего необходимого для создания березки. Если вас интересует это дерево, сразу переходите к статье, разбирайтесь и начинайте делать, так как по сути это и нет сложно как может показаться при первом ознакомлении, главное начать, а потом все пойдет гладко и вы не заметите как станете любить бисероплетение и начнете составлять схемы самостоятельно или просто делать без каких либо схем.

Если вам нравятся деревья, можете также попробовать сделать сакуру, для этого мы подготовили для вас статью – Сакура из бисера мастер-класс
Это чудесное дерево вы сможете сделать сами и скажем больше, вы сможете сделать даже лучше, так как оно было сделано для примера и для того, чтобы показать вам основы и чтобы вы поняли, что бисероплетение – это не сложно. Сакуру можно сделать пышнее и ствол дерева можно сделать более текстурированным и разукрасить по вашему вкусу.

Из бисера можно делать очень много красивых вещей и одни из них это цветы из бисера. Делать их немного сложнее чем деревья, но все же если есть много фото и описание – хороший мастеркласс – тогда ничего сложного в этом нет и как всегда, главное начать. Цветы делаются в несколько этапов. Сначала нужно сделать лепестки, потом сердцевину или пестик, и, напоследок листочки и ствол. Еще можно сделать подставку самостоятельно или просто поставить в красивую небольшую вазу. Для лучшей устойчивости, если вы купите горшочек или вазочку, нужно заполнить ее чем-то тяжелым, например песком или морскими камушками. При этом, если морские камушки будут выглядывать вверху – это придаст более красивый и дизайнерский вид.

Эти цветы можно посмотреть в виде мастеркласса,
перейдите по ссылке – Цветы из бисера схемы
В этой статье предоставлено очень много фото и подробное описание, потому вам не составит труда самому разобраться и сделать такие же или похожие цветы. Начинайте и у вас все получится.

Пасхальные яйца из бисера, схемы и мастер-класс

Если вы любите христианские праздники и относитесь к ним серьезно, тогда вам знакомо Рождество Христово и праздник Пасха. И как вы знаете на этот праздник принято красить яйца, а еще их разукрашивают, клеят красивые наклейки и даже делают из дерева и из бисера.

Это очень красиво и если вы желаете сделать сами что-то подобное, переходите по ссылке – Пасхальные яйца из бисера мастер-класс и схемы
Тут нет придела фантазии, главное знать основы плетения из бисера яиц, а остальное уже на ваше усмотрение. Вы можете сделать даже яйцо Фаберже, только из бисера. Предоставлены схемы нескольких яиц, потому у вас есть выбор и вы сможете начать делать любое из них, а в итоге сделать свое уникальное.

Картины и панно из бисера схемы и мастер-класс

Бисероплетение – это хобби в котором нет границ и подтверждение тому картины и панно из бисера. А в чем отличие картины от панно? В том что в последнем есть объем и его не так сложно сделать, как кажется на первый взгляд. Если вы интересуетесь этим направлением, переходите по ссылке – Картины и панно из бисера схемы

Бисероплетение – это просто и вы убедитесь в этом, когда начнете делать что-то сами. Вверху слева указаны все категории сайта, выбирайте любую, смотрите что вам по душе и приступайте к мастерству и да прибудет с вами удача.

Берёзка из бисера. Береза из бисера. Плетение основы березки

Береза является символом славянского народа, деревом, воспетым в песнях и стихах поэтов. Согласно легендам, это благословенное дерево укрыло своими ветвями страждущих и помогло им пережить непогоду. Женская символика проявляется уже в самом названии, ведь в свадебных обрядах береза ассоциируется с невестой . Техника плетения дерева проста, нужно только проявить терпение, чтобы научиться плести березу из бисера.

Как правильно сделать березу из бисера

Мастер-класс для начинающих по плетению березы из бисера

Тонкие веточки березы символизируют нежность и чистоту. И именно этого эффекта и нужно добиться в плетении дерева.

Для создания листочков вам понадобится:

• бисер одного номера трех оттенков зеленого цвета – по 100 г каждого цвета;
• проволока для бисероплетения медная 0,2 мм.

Порядок работы:

Самые короткие пойдут на верхушку дерева, так что их нужно заготовить 10-12 штук. Из более длинных впоследствии сформируем основные веточки. Всего нужно сделать около 150 заготовок веточек.

Сборка веточек

Вам понадобится:

• заготовки для веточек;

• проволока 0,25 мм;
• нитки мулине зеленого цвета.

Порядок работы:

• для веточки нужно взять 2-3 тоненькие заготовки и скрутить проволоку вместе по всей длине;
• отрежьте 10 см проволоки 1 мм в диаметре и сформируйте более толстые ветки;
• приложите отрезок толстой проволоки к основанию веточки (место, где листочки соединяются вместе) и смотайте все вместе нитками мулине;
• длина обмотки – 2 см.

Сначала соедините веточки для верхушки. Это заготовки с количеством петель, равным 9. Оформите таким образом все остальные заготовки. Старайтесь совместить на одной веточки заготовки с разным количеством петелек – так дерево будет выглядеть более естественно.

Формирование больших веток

Вам понадобится:

• проволока диаметром 1,5 мм;

• собранные заготовки;
• нитки мулине зеленые.

Порядок работы:

• возьмите 2 ветки, сложите их вместе и приложите отрезок проволоки;
• смотайте веточки зеленой ниткой;
• по мере смотки прикладывайте новые веточки так, чтобы в итоге на большой ветке у вас получилось 6-7 веток.

Сформируйте таким образом все большие ветки, но не старайтесь сделать их одинаковыми. После этого приступим к самому интересному этапу – сборке целого дерева.

Как собрать березу из бисера

Ствол березы имеет тот неповторимый окрас и рисунок, благодаря которому деревья и стали такими узнаваемыми. Но сперва его нужно сформировать и установить на подставке.

Вам понадобятся:

• заготовки больших веток;
• нитки ирис белого цвета для обматывания ствола.

Собираем березу из бисера высотой 25-27 см пошагово:

Оформление основания и ствола березы

Как сплести осеннюю березу из бисера

Деревья, раскрашенные осенними красками, особенно красивы. Желтые, красные, оранжевые листья удивительны в своем многообразии. Попробуем сплести осеннюю березу по опробованной схеме.

Для работы вам понадобится:

• прозрачный бисер желтого, золотистого и оранжевого оттенка по 70 г каждого;
• проволока медная.

Начинайте работу в петельной технике, нанизывая бисер в произвольном порядке. Продолжайте работу по общей схеме и оформите подставку в соответствующей технике.

Более яркое и заметное дерево получится из оранжевого непрозрачного бисера.

Как сплести зимнюю березу из бисера своими руками

Зимние деревья завораживают своей застывшей красотой. Не зря, ведь зимние березы так любят воспевать поэты. Попробуем и мы сплести зимнее дерево.

Тонкие веточки зимней березы без листиков с эффектом инея

Вам потребуется:

• бисер белого, серебристого цвета и стеклянные прозрачные бисерины – по 70 г каждого;
• проволока для плетения серебристая диаметром 0,2 мм.

Порядок работы:

Сделайте заготовки 100-120 веточек. Продолжайте работу по общей схеме. Но для соединения используйте только белую проволоку и белые нитки (можно взять капроновые нитки для шитья обуви).

Оформить дерево можно и в петельной технике плетения. Для этого используйте белый непрозрачный бисер и медную проволоку.

Символ будущего года – – украсит вашу праздничную елку.

Пошаговый мастер-класс по оформлению основания для березы из бисера (с фото)

Одно и то же дерево в разном оформлении смотрится уникальным и оригинальным. Рассмотрим несколько интересных вариантов оформления.

Основание зимней березы можно посыпать декоративным песком. Но предварительно намажьте основание клеем. Поверх песка насыпьте серебряный микробисер:

Основание летней березки можно украсить натуральными камушками или сделать из камней маленькие грибочки:

• Береза и — рябина— из бисера могут стать достойным оформлением для сказочного сада. На видео показаны примеры того, как своими руками создать чудесный лес, в котором живет Дед Мороз. А для компании можете сплести самых разных .

• Пошаговое видео от начала плетения до оформления веточек березы и покраски ствола. – удивительной красоты разноцветное дерево, которое нужно сплести непременно.

Расскажите, насколько вам близка тема плетения деревьев из бисера? Хотите освоить создание березки в разное время года? Напишите в комментариях, будем благодарны.

Самим можно сделать любое бисерное дерево в том числе и Березку. В данном мастер классе с пошаговыми фото и инструкцией, вы узнаете как сделать березу из бисера своими руками по правильной схеме.

Нам понадобится: Проволока толстая для ствола, проволока тонкая для веточек, 2 чашки гипса, бисер (смесь зеленого цвета) 500 гр., бумажное полотенце, фольга, клей ПВА, краска белая и черная, кусачки и плоскогубцы.

Начинаем делать наше дерево со ствола. Берем толстую проволоку.

Скручиваем первые веточки. Это у нас будет верхушка.

Отступаем от первых веток 5-7 см и прикручиваем следующие. Так поступаем со всей проволокой. Верхние ветки у нас длинной 10 см, а нижние по 15 см. Снизу остатки проволоки загибаем для формирования подставки.

Берем понравившуюся емкость для заливки подставки. Застилаем фольгой, чтобы было удобнее извлекать уже застывшую заготовку. Помещаем в центр нашу заготовку из проволоки и заливаем гипсом.

Остатками гипса можно придать рельефность и объем стволу нашего будущего деревца.

После полного высыхания подставку вынимаем из формы и снимаем с гипса фольгу. С помощью клея ПВА и салфеток обклеиваем и красим нашу подставку в темный цвет.

Верх подставки смазываем клеем и насыпаем сверху бисер для имитации травки. Так же можно использовать обычный речной песок, камушки или манку.

Теперь приступаем к изготовлению веточек для березки. На тонкую проволоку набираем бисер. Длину проволоки надо заполнить не менее чем на половину.

Отступив от края проволоки 10 см. отсчитываем 8 бисеринок для первого листика.

Скручиваем петельку.

Делаем еще 5-6 скручиваний для формирования ножки листика. Скручивания можно делать и больше, и меньше. Просто от этого поменяется вид самой веточки. Это зависит от вашего желания.

Отступив 1,5 см. формируем следующую петельку для следующего листика.

Мы делаем короткую веточку так что на пяток листике делаем поворот.

И продолжаем делать листики уже для второй стороны веточки.

Сделав первый листик скручиваем вместе обе стороны ветки до начала ножки следующего листика.

Продолжаем делать листики до края второй стороны.

Выравниваем свободные концы проволоки, скручиваем их между собой и обрезаем лишнее. Первая веточка у нас готова.

Нам нужно сделать для нашей березки 144 длинных веточек (с 15 листиками) и 58 коротких (с 9 листиками).

Берем 4 коротких веточки и скручиваем их в одну пушистую ветвь.

С помощью проволоки или ниток крепим нашу ветвь к верхушке нашего деревца.

Берем следующие три коротких веточки и формируем из них одну пушистую ветвь.

Делаем три таких пушистых ветки. Отступаем от верхушечной 3-4 см. и прикрепляем все три на одном уровне к стволу. Потом отступив еще 3-4 см. крепим еще такие же три пушистые ветви. Верхушка у нас полностью закончена.

Теперь переходим к заполнению боковых ветвей. Снова берем 3 короткие веточки, скручиваем их между собой и прикрепляем на кончик ветки.

Теперь переходим к длинным веточкам. Берем 3 длинные, скручиваем вместе.

Берем такие две пушистые ветви и крепим их на ветку отступив от уже прикрепленной 4-5 см.

Снова берем 2 пушистые ветви и так же прикрепляем их ветке отступив от предыдущих ветвей 4-5 см.

Так заполняем все наши веточки.

Когда все ветки прикреплены переходим к обматыванию веток салфетками. Обматывать начинаем с боковых ветвей.

Закончив с боковыми ветвями начинаем обматывать центральный ствол начиная с верхушки.

Так выглядит полностью обмотанное деревце. Берем клей ПВА и белую краску смешиваем 1х1, и покрываем этой жидкостью все ветки и ствол.

После просыхания белой краски наносим темную (тоже смашенную с ПВА). Красим полностью в темный цвет верхушку и боковые ветви. На ствол наносим краску штрихами, чтобы добиться схожести со стволом Березы.

При покраске у нас все ветки оставались в сжатом виде.

Теперь их можно расправить и придать нужный изгиб.

Все наша березка готова. Эта березка высотой 60 см. При желании можно сделать более компактное деревце.

Попробуйте сделать вот такое замечательное миниатюрное деревце из бисера своими руками.

Нам понадобится:

Бисерная смесь зелёного цвета – 40-50 грамм;

Бисерные деревья хороши тем, что для них годится даже бисер неправильной формы, который нельзя использовать во многих украшениях, или бисер, которого осталось слишком мало.

Возьмите за основу зелёный бисер любых оттенков (кроме очень тёмных). Можно использовать остатки разного по фактуре и прозрачности бисера – от салатового до насыщенного изумрудного. Добавьте по несколько щепоток жёлтого, золотого или оранжевого бисера. Перемешайте смесь.

Как определить количество проволоки

При изготовлении маленьких веточек нужно, чтобы у каждой из них оставался черешок 5-7 сантиметров. Если позволяет проволока, вы можете формировать более длинные веточки. Но в нашем случае проволоки было немного – около тридцати метров, а деревце хотелось сделать попышнее. На длинные ветки её просто бы не хватило. Поскольку сделать надо, ориентировочно, 50 веточек, то получается, что на каждую веточку можно использовать до 40 см проволоки.

Изготовление маленьких веточек

Нанизываем 8-9 бисерин, помещаем посередине проволочки и сворачиваем петелькой. Одной рукой крепко удерживаем сложенные вдвое проволочки, а другой прокручиваем петельку несколько раз вокруг своей оси, пока не образуется небольшая ножка (фото 1).

Опять нанизываем то же количество бисера и делаем еще две петельки слева и справа от центрального листика. Так мы изготовили макушку веточки.

Число петелек-листочков может быть от 4-6 для самых маленьких веток (их немного) до 8-12, если у вас имеются запасы проволоки (фото 4).

Перекручиваем вместе обе стороны веточки (фото 5).

Таких веточек заготавливаем порядка пятидесяти штук или больше. Листики слегка изгибаем вовнутрь, чтобы веточки выглядели более живо (фото 6).

Берем отрезки проволоки потолще 12-15 см длиной. Самую первую веточку прикручиваем нитками к проволоке-основе, чтобы скрыть конец проволоки (фото 7).

Этот небольшой участок обматываем монтажным скотчем или бумажным лейкопластырем (фото 8).

Приматываем остальные маленькие веточки, собирая так 10-12 больших веток (фото 9-10).

Теперь формируем само деревце.

Для ствола можно использовать настоящую веточку, кусок алюминиевой проволоки или карандаш.

Макушки, как известно, берёза не имеет, потому в верхнем ярусе закрепляем 4 свободно спадающие ветки. Далее распределяем остальные в несколько ярусов (фото 11-12).

На ствол внизу приматываем несколько изогнутых под прямым углом прочных проволочек, подобно крестовине для новогодней ёлки. Они нужны для устойчивости деревца (фото 13-14).

Закрепим наше деревце на подставке .

Для этого разводим гипс пополам с водой до густой сметанообразной массы. Застилаем дно выбранной ёмкости полиэтиленом, устанавливаем деревце и заполняем ёмкость гипсом (фото 15-16-17).

Оставляем гипс «схватиться» хотя бы полчаса. Поставьте вокруг кроны коробки или прочие предметы, которые помогут удержать его в вертикальном положении.

Аккуратно обернём каждую маленькую веточку фольгой, чтобы не запачкать во время дальнейших работ (фото 18).

Разводим гипс наполовину с ПВА, перемешиваем, пока не исчезнут комочки. Теперь кистью тонким слоем проходим составом все обмотанные нами веточки и ствол деревца (фото 19).

Большой слой, тем более, на гибких веточках, может растрескаться и отлететь. На неподвижный ствол можно нанести массу более толстым слоем.

Когда поверхность начнет подсыхать, стеком или заострённой палочкой сделайте бороздки на «коре» дерева.

После полного высыхания состава красим деревце белым акрилом и наносим чёрные полоски на ствол и ветки. Кончики веток можно слегка затемнить. Можно также обработать поверхность коры и веточек лаком.

Снимаем фольгу с веточек и вынимаем деревце из формы. По диаметру подставки завязываем зелёную атласную ленточку, намазываем верх подставки густым слоем ПВА и посыпаем бисером, блёстками или камушками (фото 20).

Можем поздравить Вас! Ваше первое деревце – берёзка из бисера готово.

Полученные навыки вы можете применить для изготовления и других деревьев, изменяя по необходимости длину, форму и цвет веточек и по-разному формируя крону. (фото 21)

Мастер-класс предоставлен Гузевой Лилией.

Присоединяйтесь к нашей группе «Вконтакте»

Этот мастер-класс для тех, кто любит плести из бисера.

Для создания березы нам потребуется:
— бисер зеленый трех оттенков;
— проволока разного диаметра;
— нитки швейные для обмотки или флорлента;
— краски акриловые и лак акриловый;
— клей ПВА;
— и алебастр (гипс строительный).
Итак, приступим. На начальном этапе нам необходимо сделать маленькие веточки около 150 штук. Для этого нанизываем бисер на проволоку сеченим 0,2-0,25 мм.

Петельки делаем маленькие. Расстояние между петельками около 1 см.

Количество петелек может быть разное, в зависимости от длины веточки. Затем складываем веточку пополам и скручиваем. Веточки покороче делаем для верхушки дерева.

После того как сплетено необходимое количество веточек, соединяем (скручиваем) их по 2-3 штуки вместе.

Затем берём проволоку диаметром 0,8-1 мм и приматываем её нитками к веточкам. Обмотку делаем см 2-2,5. Так поступаем со всеми двойными и тройными веточками.

Приступаем к формированию больших веточек. На этом этапе используем проволоку Ф мм 1,5.

Берем веточку и приматываем к ней еще одну вместе с проволокой. Ниже отступаем см 1,5-2 и приматываем другую. Вот, что должно получиться.

Делаем веточки все разные. Например, такие.

Собираем верхушку дерева. А затем к ней по кругу добавляем еще 2-4 веточки.

Далее утолщаем ствол, используя отрезок алюминиевой проволоки толщиной 5 мм. Обматываем крепко нитками (я, к примеру, беру ирис, они толще швейных). Если есть в наличии флористическая лента, то можно воспользоваться и ей!

Постепенно формируем дерево. Приматали веточку, ниже см на 5 следующую. Не забываем утолщать ствол алюминиевой проволкой. У меня на ствол уходит три отрезка. Береза у меня получилась высотой 30 см.

Теперь формирум корни дерева. Вот, что получилось.

Теперь нам надо посадить нашу березку. Берем емкость, застилаем целлофановый пакет. Разводим алебастр и воду, только не слишком густо, сажаем дерево и заливаем эту смесь в емкость. Ждем, пока смесь застынет, станет довольно крепкой, извлекаем дерево, убирем пакет.

Затем разводим смесь из алебастра и клея ПВА до густоты сметаны и наносим на каждую веточку кисточкой плоской! На ствол наносим в два слоя, предварительно дать высохнуть первому.

Как только первый слой на стволе засох, наносим второй и делаем бороздки острым предметом.

Я обычно оставляю на ночь, чтоб хорошо затвердело. Начинаем красить сначала белыми красками. Обязательно краска должна хорошо высохнуть, иначе, когда будете наносить черную, краска размажется или потечет! Ждем около 2 часов.

Закрашиваем ствол черной краской. Берем широкую жесткую и кисть и наносим точечными мазками. Красить надо сухой кистью.

Декорируем полянку мхом или бисером, закрашиваем подставку, покрываем нашу березку акриловым лаком, расправляем аккуратно все веточки. Ура! Наше дерево готово.

Вот такая получилась березка. Буду очень рада, если мой мастер-класс пригодится.

Предлагаю вам заняться изготовлением березки. В этом мастер-классе я опишу шаг за шагом, как плести березу из бисера. Как всегда мастер-класс будет содержать не только описание, но и пошаговые фото плетения.

Для плетения нам потребуется:

• Бисер двух цветов: зелёный и светло-зелёный. Размер №10 (если чешский) или №12 (китайский).
• Проволока диаметром 0,3 мм и более толстая.
• Молярный скотч, нитки (ирис) — этим нужно будет обматывать ствол.
• Акриловые краски белого цвета.
• Алебастр.

Плетем березу из бисера своими руками

Начинать плести берёзу из бисера будем с её веточек. Нужно смешать 2 оттенка зелёного бисера, я смешивала зелёный и светло зелёный. После смешивания, приступаем к плетению веточек берёзы, их нужно сделать 72 шт.

Отрезаем проволоки 46-47 см, набираем на неё 9 бисерин, располагаем их на 6-7 см от края и делаем петельку. Прокрут делаем в 5-6 оборотов.

Теперь берём проволоку с плетёными петельками, складываем её пополам так, чтобы 1 петелька была наверху, а по бокам по 4 и начинаем скручивать её между собой до конца.

Таким же методом плетём остальные веточки. Когда сплели нужное нам количество (72шт) приступаем к формированию ветвей.

Берём 2 веточки, скручиваем их между собой, потом к ним прикручиваем третью.

Из остальных делаем точно такие же ветви. Всего их должно получиться 24 шт.

Сборка березы из бисера

Вообще дерево берёзки можно собрать по всякому, ведь в природе она растёт по-разному. Я вам приведу один из вариантов, как можно собрать берёзу из бисера. Состоять березка будет из двух стволов — основного большого и маленького.

• Сначала собираем большое дерево.

Берём 3 ветви и скручиваем их вместе.

Потом к этим ветвям подставляем толстую проволоку (длиной около 33 см) и обматываем нитками, по ходу прикрепляя ветви в таком порядке: см рисунок. На основной ствол дерева, веток берём в таком количестве: верхушка 3 шт, по кругу 13.

• Сборка второго ствола (маленького).

Делается аналогично первому, отличие только в количестве веток: на верхушку делаем 2 веточки, по кругу 6.

Мастер клас береза из бисера

Скачать мастер клас береза из бисера djvu

Мастер-класс по бисероплетению «Русская берёзка». Методическое пособие для педагогов дополнительного образования и учителей технологии. В нём дано пошаговое описание технологического процесса изготовления берёзки из бисера.

Подготовила педагог дополнительного образования высшей категории. МБОУ ДО ГДДТ г. Шахты Н.Б. Жеребцова. Простой мастер-класс как изготовить березу своими руками. Фото и видео-обзоры оригинальных изделий.  Береза из бисера: красивые и оригинальные изделия своими руками. Подробная технология плетения бисером в домашних условиях + фото готовых работ.

Бисер один из самых распространенных материалов среди рукодельниц. Его используют в вязании, при вышивке и выкладывании мозаичных произведений. Обычно изготовлением поделок из бисера занимаются люди усидчивые, склонные к тщательной и кропотливой работе. Их труд вознаграждается сторицей – любое изделие из бисера смотрится элегантно и эффектно. Мастер-класс «Тюльпан из бисера» Недавно решила посмотреть, как делаются из бисера цветы.

Я начинающая » мастерица», поэтому решила начать с малого-нашла самый простой тюльпанчик,. Поделка из бисера «Рябина» Представляю Вашему вниманию проделку из бисера «Рябина». Данная поделка подходит для участия в конкурсах по рукоделию, на различных выставках,. Библиотека изображений  Формирование экологических знаний. Конспект познавательной прогулки «Наблюдение за березами поздней осенью» Цель: формировать знания об Мастер-класс по объёмной аппликации с элементами рисования «Жил, да был чёрный кот!».

Мастер-класс для начинающих по плетению березы из бисера. Как собрать березу из бисера. Как сплести осеннюю березу из бисера. Как сплести зимнюю березу из бисера своими руками. Пошаговый мастер-класс по оформлению основания для березы из бисера (с фото).

Видео с мастер-классом по плетению и оформлению березы из бисера. Береза является символом славянского народа, деревом, воспетым в песнях и стихах поэтов.  Пошаговый мастер-класс по оформлению основания для березы из бисера (с фото). Одно и то же дерево в разном оформлении смотрится уникальным и оригинальным. Рассмотрим несколько интересных вариантов оформления. Символом весны и красоты является березка.

Она очень изящная, красивая и полезная. Почему бы не завестись такой красотой дома? Чаще всего, рукодельницы начинают свою работу именно с этого дерева. Сегодня я вам покажу несложный мастер класс по ее изготовлению. Высотой она получиться примерно 20 сантиметров.

Для веток, нам понадобиться два оттенка чешского бисера: Темно-зеленый – 25 гр; ярко-зеленый – 10 гр; Проволока (коричневая) 0,03 – 1 катушка; Нитки; Проволока толстая (для формирования веток и ствола) – 2 штуки по 25 сантиметров.

Мастер-класс для начинающих по плетению березы из бисера. Тонкие веточки березы символизируют нежность и чистоту. И именно этого эффекта и нужно добиться в плетении дерева.  Наш мастер класс подходит к концу, и вы уже видите, что ваша береза из бисера готова. Однако для того чтобы дерево красиво смотрелось ему нужна специальная подставка.

Делаем подставку и декорируем дерево. Мастер класс закончен по созданию летней белой березы из бисера. Также можно сделать очаровательную березку по-осеннему, заменить зеленый бисер на темно-желтый. Удивительно и ярко смотрятся изделия, сделанные из пайеток. Своим красочным видом притягивают сакура, березка, клен, зимние варианты.

Успехов Вам в творении, милые рукодельницы, фантазируйте и создавайте свои эксклюзивные поделки! Так выглядит настоящая белоствольная берёза. Видео мастер класс “Берёза из бисера”.

Береза из бисера: мастер-класс с пошаговым фото позволит создать вам уникальное и красивое изделие в виде дерева – одного из символов страны. Плетение листиков. Бисероплетение березы начинается с листиков.  Рассмотрим следующий этап, как сделать березу из бисера – формируем ветви.

Мастер-класс по созданию листвы березы из бисера своими руками начинается с того, что веточки, сформированные в предыдущем этапе, необходимо соединить между собой.

Ветки с девятью петельками нужно скрутить друг с другом по три одинаковых штуки, также поступаем и с веточками, состоящими из одиннадцати петелек.

txt, doc, PDF, PDF

Похожее:

Вірш про зиму 3 клас

Завдання моніторинг з української мови 10 клас

Тема подорож картою україни 3 клас

Проект первоцвіт 2 клас

Фізика збірник задач 7 клас гельфгат ненашев гдз

Гра з інформатики 2 клас

Юридична англійська мова

Гдз 9 клас історія україни зошит

Мастер клас деревья из бисера

Скачать мастер клас деревья из бисера djvu

деревья из бисера. Результат поиска: найдено материалов. Дневники () Фото (+) Группы (1).  Хотелось сделать что-то разноцветное и яркое. Вот что у меня получилось из обычного бисера и проволоки. + 1 ноября года. Мастер классы» Бисероплетение» Деревья из бисера. Деревья из бисера. Џодкатегории: Бисероплетение цветов.  Дерево из бисера – это настоящее чудо! При правильном изготовлении они смотрятся как живые бонсайчики, напоминают нам о нежности, весне и легком.

Читать далее. 16 0. Дерево из бисера «Цветущая вишня на камне». Мастер-класс с пошаговыми фото. Часть 2-я. Продолжаем наш мастер-класс, в котором мы создаем дерево из бисера своими руками «Цветущая вишня на камне», начало работы вы найдете здесь. Читать далее. 11 0. Как вам деревце из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо.

snt63.ru Дерево из бисера «Дионис» Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост!  Мастер-класс бонсай из бисера для рукодельниц Мастер-класс по плетению бонсая из бисера не сложный, главное вдохновиться и запастись терпением.

В результате вы получите сказочной красоты дерево Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Глициния из бисера | Деревья из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Береза из бисера | Деревья из бисера Людмила Бурлаченко Бисер. ДЕРЕВЬЯ. Пост! Спасибо. snt63.ru Деревья из бисера для начинающих. Примеры плетения. Поделки ручной работы имеют особую ценность, пусть даже сделанные неопытным мастером и недостаточно аккуратно.  Бисер — виды и советы как выбрать.

Мастер-классы создания деревьев из бисера. Дерево в стиле инь-янь. Денежное дерево. Дерево из бисера и камней. Сакура. Осеннее дерево. Дерево из бисера-1/2 Мандарин из бисера и бусин. Сборка. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 3. Текущее видео. Дерево из бисера — 1.Мандарин из бисера. Веточки. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера.

1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 4. Текущее видео. Дерево из бисера. Вишня из бисера и бусин. Пошаговый МК. Видео урок. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. 1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера. • 5. Текущее видео. Дерево из бисера. САКУРА из бисера и бусин. Пошаговый МК.  Дерево из бисера 1/2 часть. Жакаранда Дельта комнатная. Мастер класс. Пошаговый МК.

1.Украшения, Деревья и Цветы из бисера.

Красивые деревья из бисера схемы плетения. Березка из бисера своими руками. Мастер-класс по изготовлению символичного дерева иньянь из бисера.  Как сделать из бисера крону бонсая своими руками: мастер-класс. В начале мк, возьмите проволоку длинной примерно пол метра и проденьте на нее 8 бисеринок. Образовавшуюся петлю скрутите в два оборота. Мастер класс по изготовлению бисерного дерева своими руками с помощью набора для рукоделия. В наборе для Дерево из бисера.

Как сделать ствол из ГИПСА. МК Бонсай из бисера✔️. Творческая Семья.  Мастер-класс по созданию дерева из бисера. Формирование ствола дерева из смеси шпатлевки, клея ПВА и воды. Дерево из бисера «Дионис». Цветы из бисера. Views K3 years ago. Вконтакте id, П Проволоку для оси agroru/provoloka-pchelovodn. Предлагается мастер класс о том, как изготовить из бисера классическое дерево бонсай, с коротким толстым стволом.

Для плетения используется бисер темно-зеленого цвета и проволока диаметром 0,3 мм. Порядок работ следующий: На проволоку надевается 8 бисеринок, из них получается колечко. На второй конец проволоки тоже надевается 8 бисерин, и сворачивается такое же кольцо. Это получаются зеленые листики на проволочной ветке.

На все дерево делается таких листиков, но если дерево задумано небольшое, можно обойтись и меньшим количеством. Скрутив листики по три вместе, получаем 50 веточек. Видео у.

EPUB, fb2, doc, EPUB

Похожее:

Є.п.нелін геометрія 11 клас

Всемирная история 8 клас гісем

Текст для аудіювання 8 клас з відповідями

Англійська мова 7 класс карпюк зошит 2015

Практична робота визначення коефіцієнта поверхневого натягу рідини

Гдз по матиматике за 6 клас

Індикатори вікіпедія хімія

Кросворд про плазунів з відповідями біологія

Карен Энн Хоффман (Онейда, штат Висконсин)

Музыка: «Нью-Йорк» сочинена и исполнена Костой Т. с компакт-диска Soul Sand , любезно предоставленного Free Music Archive.

( Музыка вверх )

Карен Энн Хоффман: 10.0pt; font-family: «Arial», sans-serif «> Для меня каждое действительно хорошее изделие из выпуклого бисера ирокезов, которое я когда-либо видела, так или иначе обведено кругом, и мне приходится понимать, что каждый из них Эти бусы символизируют всех ирокезов, которые когда-либо были, всех нас, живущих в настоящее время, и всех тех, чьи лица нам еще предстоит увидеть.

Джо Рид: Это ирокезский мастер по изготовлению бисера и стипендиат Национального наследия 2020 Карен Энн Хоффман, а это Art Works , еженедельный подкаст, выпускаемый Национальным фондом искусств. Я Джозефин Рид.

В течение последних двадцати пяти лет Карен Энн Хоффман нашла свой художественный голос в создании произведений искусства с использованием техники ирокезской вышивки бисером. Работа из бисера уникальна для конфедерации ирокезов. . Вышивка из бисера, созданная Ирокезом, состоит из линий бусинок, изгибающихся над материалом, которые придают произведению искусства объемность.Работы Карен Энн переосмысливают существующие формы, оставаясь при этом глубоко укоренившимися в культуре и традициях ирокезов. Некоторые произведения напоминают древние легенды, другие касаются текущих социальных проблем, а третьи исследуют будущее ирокезов. Ее искусство выставлялось во многих музеях по всей стране и является частью постоянной коллекции Национального музея американских индейцев в Вашингтоне и музея Филд в Чикаго. Карен Энн, трехкратный мастер-преподаватель программы ученичества по народному искусству в Висконсине, хорошо осведомлена и увлечена искусством коренных американцев в целом и ирокезами, занимающимися изготовлением бисера в частности.Я разговаривал с ней недавно, и мы начали наш разговор с небольшой истории о путешествии народа онейда на запад, в Висконсин.

Карен Энн Хоффман: Родина мы, Онейда из Висконсина, находится на востоке, в том, что они теперь называют штатом Нью-Йорк, но примерно в 1820 году возникла проблема, скажем так, вокруг канала Эри, и в результате этого выпуски Нация онейда, жившая в то время в Нью-Йорке, была выселена со своей родины. Примерно в 1820 году значительная часть Онейдаса отправилась в трехволновое путешествие из хоумлендов в штат Висконсин.Одновременно некоторые из онейдов остались на своей родине и живут до сих пор, а другая группа онейдов перебралась в Канаду, другая часть первоначальной родины у Темзы, а еще одна группа онейдов была насильственно переселена на индийские территории. в Канзасе и Оклахоме, но я происхожу из групп, трех волн, которые покинули Нью-Йорк и приехали в Висконсин в 1820-х годах, и именно так ирокезы, выращивающие бисероплетение, нашли свой дом в Висконсине.

Джо Рид: Теперь я хочу, чтобы вы описали ирокезскую вышивку из бисера, а также объяснили нам, что отличает ее от других.

Карен Энн Хоффман: Вышивка бисером из ирокезов — красивая, редкая форма вышивки бисером Haudenosaunee. Его формы и конструкции уходят на десять, двенадцать, четырнадцать тысяч лет назад. Мы все еще используем формы и современную вышивку бисером, которые изначально были вырезаны в скале или выгравированы на ракушке; эти формы, элементы культурного содержания остаются с нами на протяжении тысячелетий, но материалы, которые мы используем для выражения этих идей, меняются. Так что теперь, вместо того, чтобы царапать ракушку или выгравировать поверхность скалы, мне выпала честь использовать стальную иглу, немного хлопковой нити, несколько красивых стеклянных бусин, и я могу выполнять эти формы в ирокезской вышивке бисером, но я Думаю, все мы знаем, что стальные иглы, хлопковая нить и бусы были подарками колонизаторов, и эти дары распространялись по всему миру.Что мне интересно, так это то, что те же самые материалы, распространенные в культурах по всему миру, создают отличительные, богатые формы искусства, в зависимости от рук, в которые они попали, и пальцев, которые сейчас исполняют эту форму искусства. Таким образом, ирокезская вышивка бисером берет наши бусинки, и вместо того, чтобы пришивать их плоско на поверхность, как это делают многие другие, мы единственные нации, которые используют наши бусины в объемном наборе, в пышной трехмерной моде, так что наша работа становится толстой. и богатый и стоит над основной тканью, на которой мы шьем; вот что делает его визуально отличительным.

Джо Рид: Создавал бисероплетение чем-то, чему вы научились дома, когда росли?

Карен Энн Хоффман: Нет, это не так, и на самом деле я считаю, что ирокезы в этой сильно арочной форме не использовали в Висконсине до 1990-х годов или около того. Видите ли, пик, пышность ирокезской вышивки бисером на самом деле приходится на середину 1800-х годов; именно тогда форма достигает того, что я называю ее зенитом. Мы, штат Висконсин, Онейда, ушли с родины на 50 лет к тому времени, когда это произошло, поэтому вышивка бисером, которую мы выполняли, не была такой же, как эта пышная форма, которая появлялась на востоке, на востоке, на родине, и это было не так. До тех пор, пока в моем случае Сэмюэл Томас и его мать, Лорна Хилл, не приехали из Ниагарского водопада, Онтарио, в Онейду, штат Висконсин, и не подарили нам выпуклую вышивку из бисера, что форма действительно загорелась в Висконсине.

Джо Рид: Не могли бы вы рассказать, что вы почувствовали, когда впервые научились вышивать бисером у Сэма Томаса и Лорны Хилл? Было ли ощущение: «О, чувак, я дома»?

Карен Энн Хоффман: Вы знаете, на что это было похоже? Я влюбился, это немедленное тепло, это немедленное желание узнать больше, эта идея, что вы не можете отделить себя от объекта своей любви. Вот что я чувствовал. Мне просто нужно было узнавать об этом все больше и больше. Я думаю, что я был подходящим учеником в нужное время, с подходящими учителями и правильной системой поддержки, и все эти вещи объединились, чтобы дать мне возможность по-настоящему учиться и действительно исследовать этот удивительный вид искусства, и я очень благодарен для тех случайностей обстоятельств, которые встретились на моем пути.

Джо Рид: Вы сказали, что есть три вида вышитых из бисера ирокезов, и вы описали некоторые элементы древнего искусства и то, как оно было возрождено в середине девятнадцатого века, а затем есть еще две нити и я я бы хотел, чтобы вы описали их.

Карен Энн Хоффман: Итак, я говорю о популярной форме вышивки бисером из ирокезов, «прихоти», многие люди знают это как туристические товары, которые преднамеренно создавались для продажи отличными бизнесменами. откуда пришли мои люди, так что это была преднамеренная попытка производить и продавать предметы для туристической торговли; это один поток.Другой поток, о котором я знаю, — это личные вещи, регалии, церемониальные предметы; такие вещи, как правило, не продаются за пределами сообщества, хотя их вполне можно обменять внутри сообщества. Одежду, которую кто-то носит, когда они женятся, когда они умирают, когда их младенцам дают имена, эти предметы культуры не продаются, но они дарятся и передаются из поколения в поколение внутри сообщества. И третий поток и поток, который меня больше всего интересует, — это современная форма ирокезской вышивки бисером, где, будучи глубоко связанной с прошлым, форма берется, исследуется, подталкивается, расширяется и переосмысливается против современной жизни.Большая часть моей работы связана с современными проблемами, потому что мы, коренные жители, живем в центре современных проблем, и они оказывают на нас социальное влияние, и, как художники во всем мире, мы отвечаем на это социальное воздействие своим искусством. .

Джо Рид: Можете ли вы рассказать мне о своей работе? С чего начать? Как узнать, верна ли идея и что вы хотите ее реализовать?

Карен Энн Хоффман: Вы знаете, потому что он не оставит вас в покое.<смеется> Итак, я расскажу вам о пьесе, над которой сейчас работаю. На изготовление большинства моих вещей уходит около года, но они остаются в моей памяти намного дольше. Произведение, над которым я сейчас работаю, возникает из этой ситуации. Я живу в Стивенс-Пойнт, Висконсин, и пару лет назад штат Висконсин постановил, что университет, который я окончил, Стивенс-Пойнт, был построен на массовом захоронении коренных жителей. Эти туземцы умерли в конце 1800-х годов от скарлатины, и, поскольку им не разрешили в город покупать продукты, их, конечно же, не пустили в город для захоронения, поэтому их тела были выброшены в заброшенный карьер.Когда город Стивенс-Пойнт начал расти, этот карьер превратился в мусорную свалку Стивенс-Пойнт. По мере того, как город начал расти еще больше, и такие неиспользуемые земли были выделены и проданы, захоронение было невозможно продать, потому что все знали, что под ним лежат тела. В конечном счете, эта земля к 1890-м годам была передана штату Висконсин, и в начале 1890-х они построили на ней педагогическую школу Стивенс-Пойнт или педагогический колледж, и этот колледж с начала 1890-х годов и по сей день продолжает обучать студентов из разных стран. в штате Висконсин и по всем Соединенным Штатам, и люди не осознают, что каждый день, каждую неделю, каждый семестр тысячи из нас ходят по костям этих бедных мертвых индейцев.Я придерживался этой идеи пару лет, и это побуждает меня создать произведение искусства, чтобы почтить память и отдать дань уважения тем погибшим. мой разум и я не знаю, что я сознательно думаю о них все время, но очень часто в моей голове появляется законченный кусок; сплю я или бодрствую, я просто внезапно увижу законченный кусок, и тогда я пойму, что пора вынуть иголку и нитку и начать работу.А следующий год уходит на создание выкройки, узор из бисера и фактическое исполнение изделия, и это то, чем я занимаюсь сейчас.

Джо Рид: Вы все зарисовываете? Вы рисуете по ткани? Как подойти к ткани? Вы делаете выкройки? Что дальше?

Карен Энн Хоффман: Справа. Так что каждое изделие, которое я делаю, меня интересует только один раз, и это отличный способ сказать, что у вас есть возможность создавать совершенно новый объект каждый раз, когда вы садитесь за бусинки, а это означает, что вы можете полностью выяснить новый узор и строительная форма, а это означает, что вы можете исследовать геометрию своей вышивки бисером, создавать узоры и макеты, находить ошибки, вносить исправления и тратить все это время на конструирование тела объекта.Теперь это тело предмета также украшено вышивкой бисером, и когда я работаю с бисером, мне тоже не нравится вышивать одно и то же дважды, поэтому все эти рисунки также являются оригинальными для меня, а это значит, что я получаю проводить много времени, глядя на то, что я собираюсь вышить бисером. Если это дерево, я должен знать, что делает дуб дубом, а не кленом; как вы можете упростить эту форму до самой ее сути, чтобы бусинки, с которыми я работаю, могли наилучшим образом объяснить, как на самом деле выглядит дуб, и для этого нужно много проб и ошибок; это много набросков; это большая практика бисероплетения; это очень сложно сделать, чтобы просто посмотреть, правильно ли он у меня получился, прежде чем я сделаю объект, который мне нужно сделать.

Джо Рид: Какова структура этого проекта? Это будет мат? Урна? Какую форму он примет?

Карен Энн Хоффман: Итак, для этого конкретного объекта это будет аптечка, но аптечка, которую использовали перемещенные люди, которые жили в этом районе в 1820-х, 30-х и 40-х годах, так что я Я потратил много времени на изучение того, что это были за старые кожаные мешки, как они сделаны и что им нужно, чтобы быть должным образом сконструировано, и поэтому я делаю все возможное, чтобы воссоздать их для этих бедных, равнодушных индейцев. сумка, которую можно спеть и станцевать для них, чтобы они наконец могли уснуть, и это должна быть сумка, которую они узнают.

Джо Рид: А как насчет выбора цвета? Большая часть ваших работ красиво яркая, но вы склонны ограничивать количество цветов в каждой части.

Карен Энн Хоффман: Я, верю, и я всегда говорю, что работаю в том, что я называю дихроматической цветовой схемой, потому что я думаю о нескольких вещах, и одна из вещей, которые я думаю, — это отсутствие неуважения к людям. которые удивительно используют цвета, но для меня цвет может отвлекать от элегантности и точности дизайна.Многие техники могут быть скрыты за цветом, и поэтому мне нравится иметь возможность сосредоточиться на технике и точности размещения иглы, поэтому я ограничиваю свою цветовую палитру, вероятно, двумя, максимум тремя цветами, и я всегда думаю тоже что я не отвечаю за выбор этих цветов; идея, концепция, история, сказка, традиция — вот что выбирает цвета. Поэтому, когда я сделал сумку или урну, урну, в которой говорилось о воде, очевидно, она была синей, конечно, акценты были серебряными, потому что вода, пена и пена — это те цвета.Это было не мое дело, это была идея, и мне просто нужно было уйти с дороги и представлять идею.

Джо Рид: Мне интересно, Карен Энн, когда ты будешь вышивать бисером, тебе понадобится год, чтобы сделать проект. Когда вы занимаетесь бисером, это медитативно? Мне просто интересно; что ты думаешь, когда делаешь это?

Карен Энн Хоффман: Я думаю, что «медитативный» — хорошее слово, но еще одно слово, которое я хотел бы использовать, — «совершенный», потому что, когда вы садитесь с пьесой и знаете, что будете жить с ним в течение года он будет жить с вами, он будет занимать все ваше свободное время, вы должны быть привержены этому.Это как вступить в брак; вы знаете, что будут неровности и радостные моменты, но вы полны решимости довести их до конца. И поэтому я использую этот подход, когда начинаю с этих вещей, но шитье, шитье, шитье, шитье, шитье, шитье, шитье действительно становятся для меня очень медитативными. Я думаю, это похоже на пианиста, практикующего свою гамму ми-бемоль. Это сложно, однообразно, красиво, и эта музыка проникает глубоко в ваше тело и вашу душу, и как только она затрагивает эту сердцевину, вы просто следуете ей.

Джо Рид: Все, что вы делаете со своим искусством, является абсолютно преднамеренным, и вы обводите центральные образы, которые вы создаете, бусинками. Я, например, думаю о Winter Mat .

Карен Энн Хоффман: Да. да.

Джо Рид: Для этого есть причина, и я хочу, чтобы вы ею поделились.

Карен Энн Хоффман: Я так понимаю это окружение из бус. Для меня каждый действительно хороший кусок вышивки из бисера ирокезов, который я когда-либо видел, так или иначе окружен кругом, и мне приходит в голову понять, что каждая из этих бусинок символизирует всех ирокезов, которые когда-либо были, все мы, живущие в настоящее время, и все те, чьи лица нам еще предстоит увидеть, все еще нерожденные, но все мы связаны в этом действительно прекрасном связанном круге.Важно помнить, что когда вы смотрите на это окружение, не важно выделять отдельную бусинку и говорить: «О, это Карен Энн Хоффман» или «О, это, должно быть, ее отец или бабушка», или: «Это дети детей ее детей». Важно помнить, что каждая бусинка несет значительную и равную ответственность, и если хоть одна из этих бусинок вырвется, пострадает все окружение, и это говорит мне, что это моя ответственность как хорошего ирокеза.Если я или кто-либо из нас не выполняем своих обязательств перед целым, если мы терпим неудачу, если мы ссоримся, мы воздействуем на всех остальных участников этой цепочки, из прошлого, настоящего и будущего. Так что нужно знать, что важна не вы как личность, а мы как сообщество.

Джо Рид: Мне кажется, что, возможно, именно поэтому вас трижды выбирали в качестве главного учителя в программе ученичества.

Карен Энн Хоффман: Мне нравится думать, что я передаю эти идеи, которые были мне подарены, другому поколению мастеров бисера, и я действительно надеюсь, что это правда, потому что еще я действительно понимаю, что эта вышивка бисером, эти кусочки, которые выходят из моих пальцев, не представляют меня конкретно; они представляют нас в целом.

Джо Рид: Мы уже упоминали о размерности ирокезской вышивки бисером, но вы подняли ее на другой уровень в любом количестве частей и фактически создали форму урны из бисера. Мне бы очень хотелось, чтобы вы сначала описали эту форму, а затем, если сможете, поделитесь импульсом, стоящим за ней, за приданием такой структуры вышивке бисером.

Карен Энн Хоффман: Ну, я бы сказал, что не создавал эту форму, но, возможно, я оживил ее. Я был в Государственном музее Нью-Йорка, скажу так, 20 лет назад, и они были достаточно милы, чтобы позволить мне копаться в их архивах, и в том музее я увидел очень маленький контейнер из бересты. это было моим первым вдохновением.Это был держатель семян; это четыре или пять сторон, сшитых вместе, открытая вверху, выпуклая форма внизу, датированная, если не изменяет память, началом 1500-х годов, так что это был очень старый кусок, и я очень долго думал об этом время. Через некоторое время я наткнулся на несколько частей, которые должны были быть созданы в начале 1800-х годов, и они назывались jardinières, и они были похожи по форме, похожий луковичный, может быть, шести дюймов высотой, четырехсторонний сосуд, но Я принял эту форму, я взорвал ее, я преувеличил, я сделал лампочку огромной; Я сделал его 18 дюймов в высоту, а не 6.Я сделал его шириной 15 дюймов, а не 4. Я сделал углы, уши скрученными и поворачивающимися способом, которого раньше не делали, поэтому я беру эти очень старые и традиционные идеи и формы и перемещаю их в эту третью. поток современной вышивки бисером, глубоко связанный, но продвигающийся вперед, продвигающийся вперед, и это то, что я люблю делать.

Джо Рид: Мне бы хотелось, чтобы вы описали, как это было, когда вы узнали, что Урна вампума была помещена в постоянную коллекцию Национального музея американских индейцев в Вашингтоне, округ Колумбия.С.

Карен Энн Хоффман: Это было организовано для меня под руководством и с помощью Эмиля Ее Многие Лошади, удивительного бисера, с которым я познакомился, когда выставлялся на Индийском рынке Эйтельджорг в Индианаполисе. Куратор Эмиля в Смитсоновском институте, и я очень уважаю его работу. Эмиль воодушевил меня, как молодого специалиста по бисероплетению, поэтому я набрался смелости и сделал предложение, чтобы Эмиль подошел к его доске и попросил их купить эту фигуру, и когда они это сделали, я как бы понял, что мои мечты — это реальные возможности. .Другие люди считали, что эта работа достойна учреждения, подобного Национальному музею американских индейцев; это означало, что другие люди считали, что мои работы достигли профессиональной формы, и это подтвердило мои подозрения в отношении себя и придало мне смелости сделать шаг вперед и преследовать другие высокие идеалы. Поэтому я очень благодарен Эмилю за то, что он продемонстрировал свою веру в меня и дал мне понять, что другие видели меня таким, каким я мечтала.

Джо Рид: Я также считаю невероятным то, что несколько лет назад ваши работы были показаны в Украинском национальном музее в Чикаго.

Карен Энн Хоффман: Я знаю. Это было так здорово.

Джо Рид: Я считаю, что это здорово, потому что, конечно, они также известны своим бисероплетением.

Карен Энн Хоффман: <смеется> И я вам скажу … у вас есть минутка для истории?

Джо Рид: О да, пожалуйста.

Карен Энн Хоффман: Хорошо. Мне позвонила Колетт Леммон, куратор Музея индейцев ирокезов в Хоус-Каверн, [ф?] Нью-Йорк, и Колетт сказала, что она работает с кем-то еще, и они собирают выставку, которая будет на выставке Украинский национальный музей в Чикаго, тема — «Женщины, обладающие храбростью», и думала ли я, что хочу участвовать в этом, и мне пришлось сказать ей: «Боже, Колетт, я ценю, что ты думала обо мне, но я Я сижу здесь, в Стивенс-Пойнт, Висконсин, толстый и нахальный.Я не смелая женщина, и спасибо, но я просто не думаю, что это для меня, я просто не думаю, что мне подходит », и Колетт была очень любезна, но в то же время мой отец был очень болен, действительно болен болезнью Паркинсона; становилось очень плохо. И моя мать, его жена … с тех пор, как ей было 15, и к тому времени им было за восемьдесят, его постоянная спутница, никогда, никогда не оставляла его. Он оставался в доме моей мамы до того момента, когда он скончался, и я смотрел на нее и на ее ежедневную заботу, на эту любящую, трудную, душераздирающую работу, которую она выполняла без жалоб, и я подумал про себя, что есть смелая женщина.И в тот момент я увидел красивую розовую урну, великолепную и округлую в животе, как у женщин с ушами и руками, которые протягиваются, чтобы удерживать красивую и прочную розовую ткань французского шелка, и я знала, что у меня есть создать Женское равновесие , чтобы разделить этих женщин и эту храбрость. Так что я позвонил Колетт и сказал: «Думаю, у меня есть идея», и они были достаточно любезны, чтобы включить ее в эту действительно потрясающую выставку.

Джо Рид: Часто искусство коренных американцев отводится в сторону как ремесло, а не как изящное искусство, и я знаю, что у вас есть мысли по этому поводу, и я хотел бы, чтобы вы ими поделились.

Карен Энн Хоффман: Я знаю, что действительно высококлассное изобразительное искусство коренных американцев может идти вразрез с любым изобразительным искусством из любой части мира, и я думаю, если бы мы могли научиться обращаться изобразительного искусства с теми же критическими взглядами и той же системой ценностей, которую мы применяем, когда смотрим на голландских мастеров, мы могли бы начать понимать, что работы, создаваемые руками современных туземцев, столь же значительны, значимы, красивы и технически исполнен, как и любой другой вид искусства.Подобно тому, как люди могут диагностировать мазок кисти у Рубенса [ф?] По сравнению с хлопком Джексона Поллока, вы можете сказать, что ирокезы подняли бисероплетение между сообществами, между художниками, между мазками кисти или, я бы сказал, иглами. Вы можете держать наше искусство рядом с чьим-либо другим, и мы будем стоять прямо, потому что мы защищаем свой народ.

Джо Рид: Карен Энн, ваша работа визуально ошеломляет, и для вас это не главное; это не то, что вам нужно.

Карен Энн Хоффман: <смеется> Ага. Что ж, спасибо, <смеется> На мой взгляд, изобразительное искусство должно состоять из трех вещей. Одно из этих качеств — это то, что он должен быть визуально привлекательным; это не обязательно означает красивый, но он должен бросаться в глаза, иначе никто не будет с ним взаимодействовать, поэтому он должен быть красивым, он должен быть намеренным, что я имею в виду, изготовлен из самых лучших материалов с использованием самых лучших Техника, которую может освоить художник, и третье, что она должна быть значимой, и для меня это то, что у нее есть причина для существования, идея, которой можно поделиться, что-то, о чем можно пообщаться с аудиторией.И поэтому мне нравится, чтобы мои вещи были поразительными, чтобы кто-то взглянул еще раз, но меня больше интересует исполнение и смысл.

Джо Рид: Вы говорили о том, что видите себя и свою работу как часть континуума из прошлого в будущее, но мне интересно, если вы думаете о своей части этого континуума, какова будет ваша цель для этого? ?

Карен Энн Хоффман: Моя цель в этом континууме — не разочаровывать тех, кто так много верил и доверял мне.Недавно я сказал кому-то о другом, над чем я работаю: «О, не волнуйтесь, — сказал я им, — я верю в вас», а затем засмеялся и сказал: «Самое большое бремя в мире. мир — это когда кто-то говорит вам, что верит в вас ». Что ж, мне сказали, что люди верят в меня, и поэтому моя часть континуума — взять на себя эту ответственность действительно хорошим и решительным образом, который не обязательно выделяет меня, но подчеркивает всех тех, кто приходил раньше и пролить свет на тех, кто еще впереди, и если я смогу сделать это хорошо, то части будут жить, и они будут соответствовать этой ответственности.Узнает ли кто-нибудь мое имя в будущем или нет, на самом деле не очень важно; важно, чтобы они знали, чему меня учили и что я пытаюсь передать. И эти учения исходили не от меня; Я всего лишь проводник для игл и ниток.

Джо Рид: Что значило для вас быть названным стипендиатом национального наследия 2020 года за ваши вышивки бисером?

Карен Энн Хоффман: Для меня это большая честь, потому что я прекрасно знаю, что эта честь основана на талантах тысяч художников Хауденосауни из прошлого, которые сейчас практикуют и будут практиковать в будущем, и я беру на себя эту ответственность с благодарностью и торжественно и сделаю все возможное, чтобы соответствовать представлению, которым я был наделен.Я считаю, что моя работа — представлять все удивительные таланты, которые нас окружают, и поэтому ценю эту возможность.

Джо Рид: Карен Энн, это честь, которая так заслужена, и ваша работа потрясающе красива, визуально поражает и запоминается; Я действительно вижу это в течение долгого времени после того, как перестаю это видеть, если вы понимаете, о чем я, поэтому я думаю, что это замечательно.

Карен Энн Хоффман: Мне очень, очень приятно слышать это, и я думаю, что это понравится моим учителям, и это хорошо.Спасибо.

Джо Рид: Спасибо, Карен Энн.

Карен Энн Хоффман: Добро пожаловать.

Это ирокезская мастерская по бисероплетению и стипендиат Национального наследия 2020 года Карен Энн Хоффман. Из-за пандемии ежегодное празднование нового класса стипендиатов национального наследия состоится практически в этом году. Подробности будут доступны в ближайшее время на arts.gov. Вы слушали произведений искусства , выпущенных Национальным фондом искусств.

И не забудьте подписаться на Art Works и оставить нам рейтинг на Apple, это помогает людям нас найти. И подписывайтесь на нас в твиттере @NEAarts.

От Национального фонда искусств меня зовут Жозефина Рид. Оставайся в безопасности. Оставайся добрым. И спасибо за внимание.

###

Система глубокого обучения для выявления диабетической ретинопатии по всему спектру заболеваний

Источники данных и проектирование сети

DeepDR была разработана с использованием изображений глазного дна пациентов с диабетом, которые участвовали в Шанхайской интегрированной системе профилактики и лечения диабета (Shanghai Integration Model, SIM ) в период с 2014 по 2017 год (дополнительная таблица 1).В это исследование были включены в общей сложности 666 383 изображения глазного дна 173 346 пациентов с диабетом с записями обследования целостного глазного дна. Две фотографии сетчатки (с центрированием желтого пятна и диска зрительного нерва) ³⁰ были сделаны для каждого глаза в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения по скринингу DR ³¹ . Для каждого изображения были помечены качество изображения (общая градация, артефакты, четкость и поле), оценки DR (без DR, умеренный NPDR, умеренный NPDR, тяжелый NPDR или PDR) и диабетический макулярный отек (DME).Кроме того, 14 901 изображение было помечено поражениями сетчатки, включая микроаневризмы, CWS, твердые экссудаты и кровоизлияния.

Среди 173 346 субъектов в когорте SIM (именуемой в данном исследовании локальным набором данных) 121 342 субъекта (70%) были случайным образом выбраны в качестве обучающей выборки, а оставшиеся 52 004 субъекта (30%) служили в качестве локальной валидационной группы. (Рисунок 1). В когорте SIM-карты каждый субъект был зарегистрирован только один раз и был записан с уникальным идентификатором резидента. Таким образом, было гарантировано разделение данных между обучающими и локальными наборами данных проверки.Распространенность ДР в исследуемых когортах показана в Таблице 1. В обучающем наборе данных 12,85% изображений имели ДР, среди которых 27,94% были легкими NPDR. В наборе данных локальной проверки из 200 136 изображений 12,99% изображений имели DR, среди которых 27,30% были умеренными NPDR.

Рис. 1. Разделение данных в локальном наборе данных (когорта SIM) для обучения и локальной проверки трех подсетей системы DeepDR.

Локальный набор данных был случайным образом разделен на наборы данных для обучения и проверки.Все 466 247 изображений в наборе обучающих данных были использованы для обучения подсети оценки качества изображений. Подсеть обнаружения поражений была обучена с использованием 10280 градуированных изображений с аннотациями поражений сетчатки. Затем 415 139 градуируемых изображений в обучающем наборе использовались для обучения подсети оценки DR. Все 200 136 изображений в локальном наборе данных проверки были использованы для тестирования подсети качества изображения, а 178 907 изображений с градацией были использованы для тестирования подсети DR-градации. Наконец, 4621 градиентное изображение, помеченное поражениями сетчатки, было использовано для тестирования подсети обнаружения поражений.DR, диабетическая ретинопатия.

Таблица 1 Сводка наборов данных о разработке и валидации диабетической ретинопатии.

Система DeepDR состояла из трех подсетей глубокого обучения: подсети оценки качества изображения, подсети с учетом поражения и подсети оценки DR (рис. 2). Все 466 247 изображений в наборе обучающих данных были использованы для обучения подсети оценки качества изображения, чтобы сделать двоичную классификацию того, было ли изображение градуируемым, и распознать определенные проблемы качества с точки зрения артефактов, четкости и полевых проблем изображений сетчатки; 415 139 изображений без проблем с качеством были использованы для обучения подсети оценки DR для классификации изображений на не-DR, умеренного NPDR, умеренного NPDR, тяжелого NPDR или PDR, а также двоичной классификации наличия DME.Подсеть, осведомленная о поражениях, была обучена с использованием 10280 изображений, помеченных поражениями сетчатки, для обнаружения и сегментации микроаневризм, CWS, твердых экссудатов и кровоизлияний.

Рис. 2: Визуальная схема системы DeepDR.

Система DeepDR состояла из трех подсетей: подсети оценки качества изображения, подсети с учетом поражения и подсети оценки DR. Сначала мы предварительно обучили ResNet формированию базовой сети DR (верхний ряд). Обученные веса предварительно обученной базовой сети DR были затем распределены в трех различных подсетях системы, обозначенных красной стрелкой.Эти три подсети принимали изображения сетчатки в качестве входных данных и последовательно выполняли разные задачи. Кроме того, признаки поражения, извлеченные модулем сегментации подсети с распознаванием поражений (обозначены зеленой стрелкой), были объединены с признаками, извлеченными подсетью оценки DR (обозначенными синей стрелкой). DR — диабетическая ретинопатия; NPDR, непролиферативная диабетическая ретинопатия; PDR, пролиферативная диабетическая ретинопатия.

Как показано на рис. 2, наша система DeepDR была разработана как многозадачная сеть с использованием трансферного обучения.В частности, базовая сеть DR сначала была предварительно обучена классификации ImageNet, а затем была настроена для нашей задачи оценки DR с использованием 415 139 изображений сетчатки. Затем мы использовали обучение с переносом ³² для переноса базовой сети DR в три подсети системы DeepDR, вместо того, чтобы напрямую обучать случайно инициализированные подсети. В процессе обучения передачи мы зафиксировали предварительно обученные веса в нижних слоях базовой сети DR и повторно обучили веса ее верхних уровней с помощью обратного распространения ошибки.Этот процесс работал хорошо, поскольку функции подходили для всех учебных задач, связанных с DR (оценка качества изображения, анализ повреждений и оценка DR). Кроме того, мы объединили признаки поражения, извлеченные модулем сегментации подсети с распознаванием поражений, с признаками, извлеченными подсетью оценки DR, чтобы повысить эффективность оценки. Чтобы предотвратить переоснащение сети, был использован критерий ранней остановки ³³ для определения оптимизированного количества итераций.Для каждой задачи мы случайным образом разделили обучающий набор данных на две части, 80% данных использовалось для обучения сети, а остальные использовались для ранней остановки. Сеть тестировалась на ранней остановке набора данных каждую эпоху во время обучения, и производительность сети регистрировалась. Если площадь под кривой рабочей характеристики приемника (AUC) или приращение пересечения по объединению (IoU) было меньше 0,001 для 5 эпох непрерывно, мы прекращали обучение и выбирали лучшую модель в качестве окончательной модели.

Производительность системы DeepDR

Подсеть оценки качества изображения для оценки общего качества изображения и выявления артефактов, четкости и проблем с определением поля была протестирована с использованием 200 136 изображений в наборе данных локальной проверки. DeepDR достиг AUC 0,934 (0,929–0,938) для общего качества изображения. Для идентификации артефактов, ясности и проблем с определением поля система достигла значений AUC 0,938 (0,932–0,943), 0,920 (0,914–0,926) и 0,968 (0,962–0.973) соответственно.

Подсеть, учитывающая поражения, была оценена с использованием 4621 градуируемого изображения с аннотациями поражений сетчатки из локального набора данных проверки. Результаты показаны на рис. 3 и в дополнительной таблице 2. Для микроаневризмы AUC, чувствительность, специфичность и оценка F составили 0,901 (0,894–0,906), 88,0% (87,2–88,9%), 73,3% (72,0). –74,3%) и 0,815 соответственно. Для CWS AUC, чувствительность, специфичность и IoU составили 0,941 (0,935-0,946), 90,0% (87,9-91,9%), 83.1% (82,2–83,9%) и 0,711 соответственно. Для твердого экссудата AUC, чувствительность, специфичность и IoU составили 0,954 (0,949–0,957), 90,5% (88,9–91,5%), 85,8% (85,2–86,6%) и 0,971 соответственно. Для кровотечения AUC, чувствительность, специфичность и IoU составили 0,967 (0,965–0,969), 93,2% (92,6–94,1%), 88,0% (87,6–88,7%) и 0,738 соответственно. Подсеть, осведомленная о поражении, выделила области поражения, маскируя изображения глазного дна (рис. 3B). Чтобы облегчить использование в клинических условиях, клинический отчет может быть автоматически создан для каждого пациента (пример отчета показан на дополнительном рис.1). В этом отчете были представлены исходные изображения глазного дна с выделенными поражениями, описан тип и расположение поражений сетчатки вместе с оценкой DR. Кроме того, мы провели эксперимент, чтобы оценить полезность подсети, осведомленной о поражениях, путем измерения ее влияния на точность классификации обученных работников первичной медико-санитарной помощи из общественных центров здравоохранения. Подробный план исследования описан в дополнительной информации (раздел «Дополнительные методы»). Результаты были протестированы с использованием одностороннего двухвыборочного знакового рангового критерия Вилкоксона и показаны в таблице 2.Чувствительность всех классов DR и специфичность тяжелого DR были значительно улучшены с помощью системы DeepDR. Это говорит о том, что визуальные намеки на поражения сетчатки значительно улучшают диагностическую точность работников первичного звена здравоохранения, что может облегчить перенос задач при скрининге DR.

Рис. 3: Производительность подсети с учетом поражения.

A Кривая рабочих характеристик приемника, демонстрирующая производительность подсети с учетом поражения для обнаружения поражения сетчатки ( n = 4621). B Примеры изображений сегментации поражения сетчатки: микроаневризмы, ватные пятна, твердые экссудаты и кровоизлияния выделены зеленым цветом.

Таблица 2 Чувствительность и специфичность классификации DR работниками первичного звена здравоохранения с помощью или без помощи обнаружения и сегментации поражения.

Система DeepDR обеспечивает полную диагностику ДР от ранних до поздних стадий на основе точного обнаружения поражений сетчатки, что особенно точно при микроаневризмах.В наборе данных локальной проверки 178 907 градуируемых изображений использовались для тестирования подсети оценки DR, и результаты показаны в таблице 3. Для двух изображений на глаз наша подсеть оценки DR сделала отдельный прогноз для каждого изображения, а затем мы принял более серьезную оценку DR, полученную из этих изображений, как результат оценки для этого глаза, который использовался для расчета AUC оценок DR. Средняя AUC составила 0,955 для оценки DR. В частности, для легкого NPDR AUC, чувствительность и специфичность были равны 0.943 (0,940–0,946), 88,8% (87,7–89,7%) и 83,9% (83,7–84,1%), соответственно. Для DME AUC составляла 0,946 (0,945–0,947), чувствительность — 92,8% (92,4–93,1%), а специфичность — 81,3% (81,0–81,6%).

Таблица 3 Производительность системы DeepDR для классификации диабетической ретинопатии.

Внешняя проверка

Чтобы проверить обобщение системы, мы дополнительно оценили производительность DeepDR с использованием двух независимых реальных когорт и общедоступного набора данных EyePACS для внешней проверки.Первой когортой была когорта Китайского национального исследования диабетических осложнений (CNDCS), включающая 92 672 изображения глазного дна от 23 186 пациентов с диабетом и была получена в 2018 году. Вторая когорта — это когорта Нишенгского проекта скрининга диабета (NDSP), включающая 27 948 изображений глазного дна из 6987 пациентов. пожилые люди старше 65 лет и были приобретены в 2018 году. Распространенность диабета составляла 31,7% в когорте NDSP. Набор данных EyePACS является общедоступным набором данных из США и состоит из 88 702 изображений глазного дна.

Результаты оценки DR показаны в таблице 3. В CNDCS система DeepDR достигла AUC 0,916 (0,912–0,920) для умеренного NPDR, 0,927 (0,925–0,929) для умеренного NPDR, 0,962 (0,959–0,965) для тяжелый NPDR и 0,955 (0,949–0,961) для PDR. В наборе данных NDSP и EyePACS средние значения AUC для оценки DR составляли 0,944 и 0,943 соответственно. Система имела высокие значения AUC для легкого NPDR, достигающие 0,929 (0,916–0,942) и 0,937 (0,935–0,939) для наборов данных NDSP и EyePACS, соответственно.

Обратная связь по качеству изображения в реальном времени

Мы использовали DeepDR для обеспечения обратной связи по качеству изображения в режиме реального времени во время немидриатической фотографии сетчатки 1294 пожилых людей из когорт NDSP (возраст старше 65 лет).Были сделаны две фотографии сетчатки (в центре макулы и диска зрительного нерва) каждого глаза. Если DeepDR определил, что качество первого изображения поля не подлежит градации, второе изображение того же поля было захвачено повторно. Для каждого поля был сделан только один снимок, чтобы избежать сужения зрачков из-за вспышки камеры.

Результаты показаны в таблице 4. В ходе этого процесса было первоначально получено 5176 изображений сетчатки у 1294 пациентов. Из них 1487 изображений (28,7%) были признаны низкого качества с артефактами, четкостью и / или проблемами определения поля.На основании полученных отзывов была сделана вторая фотография этих пациентов. Для 1487 исходных изображений низкого качества 1065 (71,6%) повторно захваченных изображений были надлежащего качества. После замены изображений низкого качества повторно захваченными изображениями диагностическая точность каждой степени DR была улучшена. Специально для легких NPDR AUC увеличилась с 0,880 (0,859–0,895) до 0,933 (0,918–0,950) ( P <0,001), а чувствительность увеличилась с 78,5% (72,7–83,4%) до 87,6% (83,2–92,3%). .

Таблица 4 Влияние обратной связи по качеству в реальном времени на диагностику аварийного восстановления с использованием системы DeepDR.

Методы экстракции РНК из открытых источников и RT-qPCR для обнаружения SARS-CoV-2

Abstract

Повторное открытие сообществ в разгар продолжающейся пандемии COVID-19 вызвало новые волны инфекций во многих местах по всему миру. Снижение риска повторного открытия потребует широкомасштабного тестирования на SARS-CoV-2, чему в значительной степени способствовали бы простые, быстрые и недорогие методы тестирования. В этом исследовании оценивается несколько протоколов экстракции РНК и RT-qPCR, которые проще и дешевле, чем распространенные методы.Во-первых, показано, что осаждение изопропанолом является эффективным средством экстракции РНК из образцов мазков из носоглотки (NP). Во-вторых, оценивается прямое добавление образцов мазка NP к RT-qPCR без этапа экстракции РНК. Простое и недорогое решение для взятия мазков, подходящее для прямого добавления, проверяется с использованием искусственных образцов мазков. В-третьих, описывается мастер-микс с открытым исходным кодом для RT-qPCR, который позволяет обнаруживать вирусную РНК в образцах мазков NP с пределом обнаружения примерно 50 копий РНК на реакцию.Значения цикла количественной оценки (Cq) для очищенной РНК из 30 известных положительных клинических образцов показали сильную корреляцию (r ² = 0,98) между этим самодельным мастер-миксом и коммерческим мастер-миксом TaqPath. Наконец, было обнаружено, что флюоресцентная визуализация конечной точки обеспечивает точные диагностические данные без необходимости использования термоциклера для количественной ПЦР. Принятие этих простых методов с открытым исходным кодом может сократить время и расходы на тестирование COVID-19.

Образец цитирования: Graham TGW, Dugast-Darzacq C, Dailey GM, Nguyenla XH, Van Dis E, Esbin MN, et al.(2021) Методы экстракции РНК с открытым исходным кодом и RT-qPCR для обнаружения SARS-CoV-2. PLoS ONE 16 (2): e0246647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647

Редактор: А. М. Абд Эль-Ати, Каирский университет, ЕГИПЕТ

Поступило: 12 октября 2020 г .; Принята к печати: 25 января 2021 г .; Опубликовано: 3 февраля 2021 г.

Авторские права: © 2021 Graham et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Авторы с благодарностью признают финансирование Медицинского института Говарда Хьюза (грант CC34430, выданный R.T.). Эта работа в значительной степени финансировалась за счет собственных средств Ксавьера Дарзака и Роберта Тьяна. T.G. поддерживается постдокторской стипендией Мемориального фонда медицинских исследований Джейн Коффин Чайлдс. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Текущая глобальная пандемия SARS-CoV-2 в настоящее время заразила около 98 миллионов человек во всем мире и унесла более 2,1 миллиона жизней (Worldometer, https://www.worldometres.info/coronavirus/, доступ 1-22- 2021 г.). Однако реальное число случаев, вероятно, будет еще выше, а полное понимание масштабов пандемии затруднено из-за постоянного отсутствия повсеместного тестирования.«Золотой стандарт» теста Центров по контролю и профилактике заболеваний США на COVID-19 выявляет вирусную РНК SARS-CoV-2, очищенную из мазков из носоглотки пациентов. Исследователи и клиницисты, стремящиеся провести ОТ-ПЦР-тестирование на COVID-19, столкнулись с нехваткой необходимых реагентов для выполнения тестов в дополнение к длительному времени обработки, необходимому для каждого теста [1]. Утверждалось, что тесты, которые менее чувствительны, но более широко доступны, могут быть более полезными, чем исключительно чувствительные тесты с ограниченной доступностью [2].Использование недорогих, легко получаемых реагентов и оптимизация этапов, ограничивающих скорость, таких как экстракция РНК, помогут повысить доступность тестов и сократить время их выполнения.

Многие современные протоколы ОТ-ПЦР для обнаружения COVID-19, включая одобренный CDC тест, используют этап выделения РНК для выделения и концентрирования вирусной РНК из мазков из носоглотки пациента перед амплификацией. Обычно это включает использование набора для экстракции на основе колонки, такого как набор Qiagen QIAmp Viral RNA, или метода на основе магнитных шариков, такого как набор Roche MagNA Pure [3].Использование этих коммерческих наборов привело к нехватке поставок, что затруднило тестирование [4]. Традиционные лабораторные методы очистки РНК могут предложить менее дорогие альтернативы коммерческим наборам. Экстракция тризолом с последующим осаждением изопропанолом обеспечивает высокий выход очищенной РНК [5], однако требует значительных трудозатрат, трудно масштабировать до высокой производительности и включает опасные материалы. Сообщается, что более простые методы осаждения изопропанолом, при которых образцы мазков от пациентов сначала смешиваются с коммерческими или самодельными растворами для лизиса, дают значения Ct, сравнимые со значениями, полученными с использованием коммерческих наборов для очистки РНК [6–8].

Чтобы полностью исключить необходимость очистки РНК, несколько групп разработали протоколы для прямого добавления образцов мазков к RT-qPCR (обзор в [9]). Хотя это позволяет значительно сократить время и затраты на тестирование, отсутствие стадии очистки означает, что РНК не концентрируется, что ограничивает чувствительность обнаружения. Более того, обычно используемые растворы для взятия мазков могут ингибировать ОТ-ПЦР. Действительно, хотя несколько групп продемонстрировали амплификацию РНК путем прямого добавления образцов мазков в широко используемую вирусную транспортную среду (VTM), ингибирование RT-PCR с помощью VTM обычно приводит к значительной задержке амплификации [10–15].Сравнение коммерческих мастер-миксов показало, что обычно используемый мастер-микс TaqPath особенно чувствителен к ингибированию со стороны VTM [16].

Следовательно, исследователи искали другие решения для взятия мазков, совместимые с прямым добавлением. Было показано, что обычно используемые растворы для взятия мазков, включая универсальную транспортную среду (UTM), M6 или среду Хэнка, в некоторой степени работают при прямом добавлении [17–20]. Некоторые коммерческие растворы для лизиса, совместимые с ОТ-ПЦР, также использовались для обнаружения SARS-CoV-2 путем прямого добавления [21–23], однако высокая стоимость этих продуктов может препятствовать их широкому использованию.Идеальное решение для взятия мазков было бы широко доступным или дешевым в любой лаборатории, позволяло бы проводить чувствительное и прямое обнаружение мазков пациента и не требовало бы специальных условий хранения. Предлагаемые растворы для сбора мазков включают физиологический раствор [18], PBS [14], TE [24] или просто дистиллированную воду [15, 18]. Также сообщалось, что добавление протеиназы K (PK) к UTM или физиологическому раствору улучшает обнаружение вирусной РНК прямым добавлением [19, 25].

Наконец, большинство протоколов тестирования SARS-CoV-2 при клиническом использовании или в доклинической разработке основаны на коммерческих мастер-миксах одноэтапной ОТ-кПЦР [5, 13, 18, 19, 26–32].Однако высокая стоимость коммерческих мастер-миксов может быть недопустимой для широкомасштабного тестирования в условиях ограниченных ресурсов. Мастер-миксы, собранные с использованием самодельных ферментов, могут помочь удовлетворить эту потребность [33–35].

В настоящем исследовании оценивается несколько методов с открытым исходным кодом для диагностики SARS-CoV-2. Простой протокол осаждения изопропанолом обеспечивает эффективные средства извлечения РНК из образцов мазков из носоглотки (NP), которые подходят для последующего обнаружения RT-qPCR. В качестве альтернативного подхода прямое добавление небольших количеств образца мазка в UTM позволяет обнаруживать SARS-CoV-2, что согласуется с предыдущими отчетами, однако ингибирование реакции UTM ограничивает количество образца, которое может быть добавлено, и, следовательно, чувствительность обнаружения .Простой альтернативный раствор для взятия мазков — протеиназа K (PK) в воде — позволяет с высокой точностью детектировать РНК из , культивируемого in vitro SARS-CoV-2, в искусственно созданных образцах мазков, содержащих слизь из носа человека. Наконец, одноэтапный мастер-микс RT-qPCR, который можно собрать с использованием самодельной Taq-полимеразы и обратной транскриптазы M-MLV («BEARmix»), позволяет обнаруживать всего несколько десятков РНК на реакцию и может быть получен из относительно недорогих сырье. Взятые вместе, такие самодельные методы могут помочь избежать использования коммерческих наборов и реагентов, снизить стоимость теста и облегчить повсеместное тестирование.

Материалы и методы

In vitro транскрипция РНК гена N

Последовательность гена SARS-CoV-2 N была амплифицирована из контрольной плазмиды N-гена (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA, Cat. # 10006625) с использованием праймеров T7_nCoV_N_F (5 ‘TAATACGACTCACTATAGGGatgtctgataatggaccccaaaatc 3’) и M13 3 ‘). Его очищали в геле с использованием набора для восстановления ДНК Zymoclean Gel (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США), и ~ 70 нг очищенного в геле продукта ПЦР in vitro транскрибировали с помощью набора HiScribe T7 Quick Kit (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) в реакционной смеси объемом 20 мкл.После инкубации в течение ночи при 37 ° C РНК очищали с использованием набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Германия). Концентрацию очищенной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop и переводили в молярную концентрацию, используя расчетную молекулярную массу 4,2 × 10 ⁵ г / моль. РНК разводили до концентрации рабочего раствора 10 ⁶ молекул на мкл, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.

Получение образцов

Деидентифицированные образцы мазков из носоглотки, положительные и отрицательные на SARS-CoV-2, были получены от Kaiser Permanente Healthcare, как описано в предыдущей публикации [26].

Инактивация с помощью экрана ДНК / РНК

Для химической инактивации образцы мазков NP и образцы культивированного вируса объединяли с равным объемом 2x DNA / RNA Shield (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США) в условиях BSL3, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. . Затем образцы были перенесены в новые флаконы перед транспортировкой из помещения BSL3.

Анализы тепловой инактивации и цитопатического эффекта (CPE)

Образцы мазков из

NP в UTM были инактивированы нагреванием в условиях BSL3 с использованием одного из трех протоколов: 1) 75 ° C в течение 30 минут, 2) 95 ° C в течение 5 минут, затем 75 ° C в течение 30 минут, 3) 37 ° C в течение 30 мин в присутствии 0.4 мг / мл протеиназы К, затем 95 ° C в течение 5 минут и 75 ° C в течение 30 минут. Образцы культивированного вируса инактивировали инкубацией при 37 ° C в течение 30 минут (с 0,5 мг / мл протеиназы K или без нее), а затем при 75 ° C в течение 30 минут. Инактивированные образцы впоследствии были перенесены в новые флаконы перед транспортировкой из помещения BSL3.

Для подтверждения полной инактивации культивированный вирус разводили 1:10 в каждом растворе для сбора мазков-кандидатов или воде и подвергали тепловой инактивации, как описано выше.Инактивированный вирус добавляли к культивированным клеткам Vero E6 в условиях BSL3, и вирусную инфекцию оценивали путем оценки цитопатического эффекта (CPE) через 3 дня и 7 дней. Клетки, инокулированные неинактивированным SARS-CoV-2, служили положительным контролем.

Очистка РНК с помощью набора Qiagen RNeasy

РНК

очищали из 100 мкл каждого образца мазка с использованием набора RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия, каталожный № 74136). На первом этапе использовали 600 мкл буфера RLT, а на последнем этапе РНК элюировали 50 мкл воды.Стадия колонки с элиминатором гДНК была пропущена.

Очистка РНК с использованием мини-набора QIAmp Viral RNA Mini

РНК

очищали с использованием набора QIAmp Viral RNA Mini (Qiagen, Hilden, Germany, Cat. # 52906), следуя инструкциям производителя. Вкратце, 140 мкл каждого образца смешивали с 560 мкл буфера AVL, содержащего РНК-носитель, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления 560 мкл 100% этанола образцы пропускали через колонки для очистки центрифугированием.Колонки промывали последовательно 500 мкл буфера AW1 и 500 мкл буфера AW2, и РНК элюировали 40 мкл воды, свободной от РНКаз.

Очистка РНК с помощью набора MagMax

РНК

была очищена из культивированного вируса, разведенного в среде DNA / RNA Shield, с использованием набора для выделения вирусной РНК MagMAX ™ (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), следуя протоколу, используемому для клинических образцов в лаборатории, одобренной CLIA [26]. 450 мкл каждого образца смешивали с 10 мкл протеиназы K, 10 мкл фагового контроля MS2, 265 мкл связывающего буфера и 10 мкл магнитных шариков, и смесь инкубировали при 65 ° C в течение 10 мин.Гранулы осаждали на магнитной стойке и промывали один раз 750 мкл промывочного буфера и дважды 500 мкл 80% этанола, тщательно ресуспендировали и повторно осаждали гранулы на каждой стадии промывки. Этанол тщательно аспирировали после последней стадии промывки и шарикам давали возможность высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 2 минут. После добавления 25 мкл элюирующего раствора к каждому образцу шарики тщательно ресуспендировали путем перемешивания при 1400 об / мин в термомиксере (~ 3 мин) и инкубировали в течение 10 мин при 65 ° C.Гранулы снова осаждали на магнитной штативе и 20 мкл элюата РНК отбирали пипеткой.

Осаждение изопропанола

Образцы

мазков инактивировали с использованием тепла или защиты ДНК / РНК, как описано выше. 100 мкл каждого образца тампона смешивали в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл с 0,1 объемами 3 М ацетата натрия, pH 5,2, и 1 мкл 5 мг / мл линейного акриламида. Затем образцы смешивали с 1,1 объемами изопропанола, инкубировали при -20 ° C в течение 30 минут и центрифугировали при 16000 g в течение 15 минут при 4 ° C.Супернатанты аспирировали, стараясь не повредить осадок, содержащий РНК. К каждому образцу добавляли 1 мл 75% этанола, и образцы снова центрифугировали при 16000 g в течение 5 минут при 4 ° C. Надосадочные жидкости тщательно, но тщательно аспирировали. РНК повторно растворяли, добавляя 50 мкл воды непосредственно к каждому осадку и инкубируя в течение 10 мин при 30 ° C.

RT-qPCR с мастер-миксом TaqPath

реакций RT-qPCR с мастер-миксом TaqPath (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) были собраны в соответствии с инструкциями производителя.Для реакции объемом 20 мкл 5 мкл 4x мастер-микса TaqPath были объединены с 1,5 мкл смеси зондов CDC N1, N2 или РНКазы P для кПЦР SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA). , Cat. # 10006606), образец РНК и воду до конечного объема 20 мкл. Объемы делили на 2 для 10 мкл реакции. RT-qPCR выполняли на приборе CFX96 или CFX384 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США) со следующим циклом: 1) 25 ° C в течение 2 минут, 2) 50 ° C в течение 15 минут, 3) 95 ° C. C в течение 2 минут, 4) 95 ° C в течение 3 секунд, 5) 55 ° C в течение 30 секунд (считайте флуоресценцию), 6) переходите к шагу 4 для 44 дополнительных циклов.

Очистка ферментов и реакции BEARmix

Подробный протокол очистки ДНК-полимеразы Taq и обратной транскриптазы M-MLV и получения BEARmix можно найти на GitLab: https://gitlab.com/tjian-darzacq-lab/bearmix.

Вкратце, была приготовлена ​​смесь 4x буфер + dNTP («4xBEARbuffer + dNTPs»), содержащая следующие компоненты:

• 200 мМ Трис-HCl, pH 8,4
• 300 мМ KCl
• 12 мМ MgCl ₂
• 40% трегалоза
• 40 мМ DTT
• 0.4 мМ ЭДТА
• по 4 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Отдельно была приготовлена ​​смесь 100x ферментов («100x ферментов BEAR»), содержащая 1,6 мг / мл самодельной ДНК-полимеразы Taq и 0,17 мг / мл самодельной обратной транскриптазы M-MLV в буфере для хранения (50 мМ Tris-HCl, pH 8, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 5 мМ DTT, 0,1% Triton X-100, 50% глицерин).

Для 10 мкл реакции на льду смешивали следующие компоненты:

Блоку машины для количественной ПЦР позволяли предварительно нагреться до 50 ° C, и реакции проводили, используя следующий цикл:

1. 50 ° C в течение 10 мин
2. 95 ° C в течение 5 мин
3. 95 ° C в течение 3 с
4. 55 ° C в течение 30 с; пластина читать
5. Перейти к 3, 44 дополнительных раза

Инкубация при 95 ° C на этапе 2 была увеличена до 10 минут для экспериментов, показанных на рис. 4, и до 10, 15 или 20 минут для реакций Taq с горячим запуском на S7 рис.Всего для экспериментов на рис. 4A, S5 и S7, рис. S7 было использовано 50, а не 45 циклов.

Определение цикла количественной оценки (Cq) методом второй производной

Пользовательский код MATLAB (доступен по адресу https://gitlab.com/tjian-darzacq-lab/second-derivative-cq-analysis) использовался для получения числовой второй производной интенсивности флуоресценции как функции номера цикла, усредненного по 3-х тактное скользящее окно. Если пик второй производной был на последнем цикле, то это принималось за значение Cq.В противном случае значение Cq принималось как центр пика второй производной, как определено путем подгонки к параболе. Выбранный пользователем порог второй производной применялся ко всем образцам в каждом эксперименте, чтобы отличить амплификацию от неамплификации.

Визуализация пластин Chemidoc

96-луночных планшетов и 8-луночных стрипов визуализировали после ПЦР с использованием имидж-сканера Chemidoc MP (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Предварительная установка «флуоресцеин» использовалась для изображения флуоресценции зонда FAM со временем интегрирования 50 мс для фиг. 7A и 7B и 100 мс для фиг. 7C.Для реакций TaqPath для получения изображения флуоресценции красителя, контролирующего загрузку ROX, использовали предустановку «родамин» с временем интегрирования 500 мс. Изображения каналов флуоресцеина и родамина были наложены на Фиджи (https://imagej.net/Fiji) для рис. 7A и 7B. Трубки на рис. 7C показаны с использованием встроенной палитры «Зеленый огненно-синий» на Фиджи.

Анализ активности протеиназы К

Протеиназа K (PK) из замороженной аликвоты, хранящейся при -20 ° C, разбавляли до 200 мкг / мл либо водой, либо раствором 2 и хранили при комнатной температуре или 4 ° C в течение от 1 до 19 дней.В качестве контроля свежий ПК разбавляли до 200 мкг / мл и держали на льду в течение 15 минут до начала реакций. Каждая реакция содержала 4 мкл раствора PK, 2 мкл 1 мг / мл BSA в воде и 14 мкл воды или раствора 2. BSA добавляли последним, и реакции инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакции останавливали через 1 час добавлением 4 мкл загрузочного буфера SDS (200 мМ Tris pH 6,8, 400 мМ DTT, 10% BME, 8% SDS, 0,4% бромфенолового синего, 40% глицерина) и нагревания пробирок при 95 ° C. в течение 2 минут.12 мкл каждой реакции разделяли на градиентном геле 4–20% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Гель фиксировали и окрашивали флуоресцентным белком Flamingo (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя и отображали на системе визуализации Chemidoc (Bio-Rad). Непереваренный БСА мигрирует при ~ 66 кДа, в то время как продукты переваривания мигрируют ниже ~ 30 кДа.

Приготовление и анализ искусственных мазков

Полученные образцы тампонов были приготовлены в условиях BSL3 путем смешивания 3.2 мкл исходного вирусного раствора 3,16 x 10 ⁶ БОЕ / мл (10 ⁴ БОЕ) или разбавления 1:10 этого исходного раствора в 1x PBS (10 ³ БОЕ) на 50 мкл объединенной носовой жидкости человека (Innovative Research, Inc., Нови, Мичиган, США, продукт № IRHUNF1ML). Затем эту смесь разбавляли 1 мл 1x DNA / RNA Shield (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США), VCM с 0,4 мг / мл протеиназы K (PK) или водой с 0,4 мг / мл PK. Контрольные образцы были приготовлены с тем же количеством вируса, но без назальной жидкости.Образцы, содержащие ПК, инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, а затем инактивировали нагреванием при 75 ° C в течение 30 минут. РНК очищали с использованием набора QIAmp Viral RNA Mini, как описано выше. В качестве альтернативы, 1 мкл, 5 мкл или 13 мкл каждого образца добавляли непосредственно в BEARmix RT-qPCR. Реакции проводили, как описано выше.

Результаты

Осаждение РНК изопропанолом для обнаружения SARS-CoV-2

Простая процедура осаждения изопропанолом с использованием недорогих компонентов (см. Материалы и методы) была оценена как альтернатива коммерческим наборам для очистки РНК.При тестировании с использованием смеси РНК клеток человека и in vitro транскрибированной РНК гена SARS-CoV-2 N осаждение изопропанолом дало восстановление РНК, сравнимое с набором QIAmp Viral и значительно лучше, чем с мини-набором Qiagen RNeasy (рис. 1A). Затем осаждение изопропанола оценивали с использованием тех же образцов мазков NP в универсальной транспортной среде (UTM), описанных в предыдущей публикации [26, 36]. Для безопасности образцы сначала инактивировали одним из двух способов: образцы Pos1-Pos2 и Neg1-Neg2 смешивали с 1 объемом 2x DNA / RNA Shield, а остальные образцы (Neg3-Neg12 и Pos3-Pos12) обрабатывали 0.4 мг / мл протеиназы К в течение 30 мин при 37 ° C, нагревали при 95 ° C в течение 5 мин и затем инкубировали при 75 ° C в течение 30 мин. Затем РНК очищали с использованием набора Qiagen RNeasy Mini или осаждения изопропанолом (см. Материалы и методы; обратите внимание, что из-за нехватки поставок набор для экстракции вирусной РНК QIAmp не был доступен на момент проведения этих экспериментов). Затем очищенную РНК анализировали с использованием одобренной CDC мастер-смеси Thermo Fisher TaqPath и наборов зондов N1, N2 и РНКазы P. Из 12 известных положительных образцов 11 показали амплификацию с использованием РНК, осажденной изопропанолом, в то время как только 9 продемонстрировали амплификацию с использованием РНК, очищенной Qiagen RNeasy (рис. 1С; см. Рис. S1A для сравнения с результатами из ссылки.[36]). Образец, в котором не удалось продемонстрировать амплификацию обоими методами, Pos5, также показал очень высокие значения порогового цикла (Ct) с использованием очистки РНК на основе магнитных шариков (S1A фиг.; См. Также фиг. 5A в ссылке [36]). Относительно низкая эффективность набора Qiagen RNeasy согласуется с предыдущим отчетом, показывающим, что этот набор дает более высокие значения Cq, чем рекомендованный CDC набор для экстракции вирусной РНК QIAamp [17]. Ни один из отрицательных образцов не показал амплификации вирусной РНК с использованием любого метода экстракции, в то время как все положительные и отрицательные образцы (за исключением образца Pos5 для набора RNeasy) показали амплификацию с использованием набора положительных контрольных зондов РНКазы P человека (рис. 1B и 1C). .

Рис. 1. Экстракция РНК осаждением изопропанолом.

( A) Кривые амплификации TaqPath смеси РНК клеток человека и -транскрибированной in vitro -транскрибированной РНК гена SARS-CoV-2 N, очищенной с использованием набора Qiagen RNeasy Mini, набора QIAamp Viral RNA Mini или преципитации изопропанолом. Осаждение изопропанолом дает более эффективное восстановление РНК, чем набор RNeasy, и сравнимо с набором QIAamp Viral. (B-C) Значения Cq РНК из положительных (Pos) и отрицательных (Neg) образцов мазков NP в UTM, очищенных с использованием набора Qiagen RNeasy Mini (квадраты) или осаждения изопропанолом (ромбы).Реакции проводили с использованием мастер-микса TaqPath с зондами CDC SARS-CoV-2 N1 и N2 (синие и красные точки) и контрольным зондом РНКазы P (RP) человека (желтые точки). Для точек в сером прямоугольнике усиления не наблюдалось, и значения Cq были «неопределенными» (Undet).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g001

Прямое добавление образцов мазков к реакции ОТ-ПЦР

Потенциально более полезным, чем упрощение очистки РНК, было бы полное прекращение очистки РНК (см. Введение).Был оценен протокол прямой RT-qPCR, в котором 1 мкл каждого образца мазка в UTM был добавлен к 20 мкл реакции TaqPath, содержащей зонды N1, N2 и РНКазы P (RP) (рис. 2A). В интересах безопасности аликвоты образцов Pos1-Pos2 и Neg1-Neg2 были сначала инактивированы нагреванием в условиях BSL3 с использованием трех различных протоколов: 1) 75 ° C в течение 30 минут, 2) 95 ° C в течение 5 минут, затем 75 ° C в течение 30 минут, 3) 30 минут при 37 ° C в присутствии 0,4 мг / мл протеиназы K, затем при 95 ° C в течение 5 минут и 75 ° C в течение 30 минут.Каждый протокол включает не менее 30 минут при 75 ° C, поскольку этого оказалось достаточно для инактивации вируса (S3, рис.). Амплификация с праймерами N1 и N2 наблюдалась для обоих положительных образцов (рис. 2A). Ни один из отрицательных образцов не показал амплификации с наборами праймеров N1 и N2, а амплификация РНКазы P наблюдалась для всех образцов. Поскольку протокол 3 дал несколько более низкие значения Cq для вирусной РНК, чем протоколы 1 и 2 (рис. 2A), оставшиеся положительные и отрицательные образцы мазков NP были инактивированы нагреванием с использованием протокола 3.Затем каждый образец анализировали путем прямого добавления от 1 мкл до 20 мкл реакции TaqPath с зондами N1, N2 и RP. Амплификация наблюдалась с использованием как N1, так и N2 в 10 из 12 положительных образцов и 0 из 12 отрицательных образцов (рис. 2A и 2B). По сравнению с РНК, осажденной изопропанолом (см. Фиг. 1B, 1C, 2A и 2B), амплификация задерживалась в среднем на 4,2 цикла (диапазон от 2,3 до 5,8 цикла) для зонда N1 и на 3,8 цикла (диапазон от -0,9 до 6,8 цикла) для датчик N2. Образец Pos3, который имел самые высокие значения Cq для N1 и N2 при использовании метода осаждения изопропанолом, показал очень позднюю амплификацию с N2, но не с N1.Все образцы показали амплификацию с использованием контрольного зонда РНКазы P. Таким образом, результаты прямого добавления 1 мкл образца мазка в большинстве случаев совпадали с результатами стандартного анализа на основе очистки РНК.

Рис. 2. Прямое добавление образцов мазков к ОТ-ПЦР.

( A) Прямое добавление 1 мкл образца тампона к реакциям TaqPath 20 мкл, содержащим N1 (синий), N2 (красный) или РНКазу P (RP; желтый) смеси праймеров / зондов. Образцы были инактивированы нагреванием с использованием одного из трех протоколов: 1) 75 ° C в течение 30 минут, 2) 95 ° C в течение 5 минут, затем 75 ° C в течение 30 минут, 3) 37 ° C в течение 30 минут в присутствии 0.4 мг / мл протеиназы К, затем 95 ° C в течение 5 минут и 75 ° C в течение 30 минут. (B) Обнаружение SARS-CoV-2 в положительных (Pos) и отрицательных (Neg) образцах мазков NP путем прямого добавления. К каждому образцу добавляли протеиназу К до конечной концентрации 0,4 мг / мл, и образцы инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, 95 ° C в течение 5 минут и 75 ° C в течение 30 минут. 1 мкл образца тампона добавляли к 20 мкл реакционной смеси TaqPath, содержащей N1 (синий), N2 (красный) и РНКазу P (RP; желтый) смеси праймеров / зондов. (C) Прямое добавление различных количеств термоинактивированных образцов тампонов в UTM к мастер-миксу TaqPath.Указанные количества положительного образца мазка Pos1 добавляли к 20 мкл реакции TaqPath, содержащей зонд N1. См. Также S1B, рис.

.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g002

Чтобы проверить, приведет ли прямое добавление большего количества образца мазка к более низким значениям Cq, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл , 10 мкл или 12 мкл образца добавляли к 20 мкл реакции TaqPath. Несмотря на добавление вдвое большего количества РНК, значения Cq были аналогичными для 2 мкл образца и 1 мкл (рис. 2C и S1, рис.).Кроме того, амплификация тормозилась 4 мкл или более образца мазка. Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что вирусная РНК может быть обнаружена путем прямого добавления образцов мазков в UTM в мастер-микс TaqPath, если количество добавленных образцов мазков не превышает ~ 5–10% от общего объема реакции.

Разработка альтернативного решения для взятия мазков, совместимого с RT-PCR

Сбор образцов мазка в буфере, который не ингибирует RT-qPCR, позволит добавить больший объем образца мазка на реакцию, потенциально увеличивая чувствительность анализа.С этой целью было проверено, ингибируют ли различные добавки мастер-микс TaqPath при добавлении 5 мкл каждого из них к 10 мкл реакционной смеси (S2, рис.). Минимальное ингибирование TaqPath (ΔCq <0,5) наблюдалось при использовании 1x TE, 10 мМ Tris (pH 7,5, 8, 8,3 или 8,5), ≤ 2 мМ EDTA, ≤ 0,5% Triton X-100, ≤ 2% NP-40, ≤ 2% Твин-20, ≤ 2% ICA-630, ≤ 0,02% саркозила или ≤ 10 мМ DTT. Незначительное ингибирование наблюдалось для ≥ 1% Triton X-100 и 0,05% саркозила, тогда как полное ингибирование наблюдалось для 1x PBS и ≥ 0,2% саркозила. На основании этих результатов были приготовлены два раствора-кандидата, содержащие не ингибирующие компоненты - Трис-HCl, pH 8, разбавленный ЭДТА, Твин-20 и DTT - и 10 мкл in vitro транскрибированной РНК гена N, разведенной в любом из этих растворы или воду добавляли к 20 мкл реакции TaqPath.Оба раствора дали сопоставимые значения Cq для воды при каждой концентрации РНК, что указывает на то, что оба они совместимы с прямым добавлением в мастер-микс TaqPath (рис. 3A).

Рис. 3. Растворы для взятия мазков, оптимизированные для прямого добавления.

(A) RT-qPCR РНК гена N или РНК клеток человека в растворах для сбора мазков. РНК разводили до указанной концентрации в растворе 1 (10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ EDTA, 0,2% Tween 20, 0,2 мМ DTT), растворе 2 (10 мМ Tris, pH 8, 1 мМ EDTA, 0,5% Tween 20 , 0.5 мМ DTT) или воду, и по 10 мкл каждого разведения анализировали в реакциях TaqPath на 20 мкл, содержащих указанные пробы. (B) Прямое добавление к RT-qPCR культивированного SARS-CoV-2, инактивированного нагреванием с обработкой протеиназой K или без нее в воде или растворе 2 (10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20, 0,5 мМ DTT). 13,5 мкл каждого образца добавляли к 20 мкл реакции TaqPath. (C) Сравнение обнаружения вирусов прямым добавлением или экстракцией РНК с набором для выделения вирусной РНК MagMax (Thermo Fisher).Культивированный SARS-CoV-2 был разбавлен до указанного количества инфекционных единиц в воде с протеиназой K 0,4 мг / мл. РНК анализировали с использованием мастер-смеси TaqPath и смеси праймер / зонд N1 либо путем прямого добавления 13,5 мкл инактивированного нагреванием образца в 20 мкл реакционной смеси, либо путем добавления 5 мкл очищенной РНК к 20 мкл реакционной смеси. (D) Стабильность вирусной РНК в искусственных образцах мазков в растворе для сбора PK. Значения Cq для TaqPath RT-qPCR с зондом N1 только для вируса в 1x DNA / RNA Shield (черные точки) или вируса, смешанного с носовой жидкостью человека, разведенного в растворе протеиназы K и оставленного для инкубации в течение различного времени при комнатной температуре до тепловой инактивации (красные точки) или инактивации равным объемом 2x DNA / RNA Shield (синие точки).Показаны результаты для двух различных концентраций вируса.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g003

Для оценки обнаружения фактического вируса путем прямого добавления к RT-qPCR были подготовлены серийные разведения , культивированного in vitro SARS-CoV-2. в 1x PBS, и 1 объем каждого разведения смешивали с 9 объемами воды или буфера 2. Поскольку обработка протеиназой K давала более низкие значения Cq для образцов мазков NP, те же смеси были приготовлены с 500 мкг / мл протеиназы K.Все образцы инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут и инактивировали нагреванием при 75 ° C в течение 30 минут. Полную тепловую инактивацию вируса в каждом растворе подтверждали с помощью анализов цитопатического эффекта (CPE) в клетках Vero E6 (S3 фиг., См. Материалы и методы). Для данного вирусного разведения аналогичные значения Cq были получены во всех четырех растворах (рис. 3B). В отличие от образцов мазков NP, обработка 500 мкг / мл ПК не снижала значения Cq для прямого добавления культивированного вируса (см. Обсуждение).

Вышеупомянутый протокол прямого добавления сравнивался с протоколом, используемым утвержденным CLIA центром тестирования SARS-CoV-2 в Институте инновационной геномики Калифорнийского университета в Беркли, который использует набор для очистки РНК Thermo Fisher MagMax [26].Поскольку с помощью этой процедуры очистки РНК концентрируется в 18 раз, ожидается, что амплификация будет задержана примерно на 2,7 цикла в реакции прямого добавления с 13,5 мкл неконцентрированного образца по сравнению с реакцией с 5 мкл очищенной РНК. Примечательно, что наблюдалась средняя задержка в 2,5 цикла для праймера N1 (диапазон от 2,0 до 3,3), что означает, что амплификация РНК из сырого, инактивированного нагреванием вируса примерно так же эффективна, как амплификация эквивалентного количества очищенной РНК (рис. 3C). .

Поскольку было обнаружено, что протеиназа K улучшает экстракцию РНК из образцов мазков, срок годности PK оценивали в воде или растворе 2. PK разводили до 200 мкг / мл в воде или растворе 2 и хранили до 19 лет. дней при комнатной температуре или 4 ° C. Анализ протеолиза BSA использовали для измерения активности PK либо сразу после разведения, либо через 1, 5, 12 или 19 дней хранения (см. Материалы и методы). ПК оставался активным после 19 дней хранения в воде либо при комнатной температуре, либо при 4 ° C (S4, фиг.).Напротив, ПК, хранящийся в растворе 2, показал сниженную активность после 19 дней хранения при комнатной температуре (S4, фиг.). Эти эксперименты демонстрируют, что ПК можно хранить в растворе 2 при 4 ° C или в воде при 4 ° C или комнатной температуре в течение более 2 недель без заметной потери активности.

Наконец, долгосрочную стабильность вирусной РНК оценивали в образцах «искусственных мазков», состоящих из носовой жидкости человека с добавлением культивированного SARS-CoV-2 и разведенным в растворе PK. Полученные образцы мазков инкубировали при комнатной температуре в течение 0, 1 или 3 дней, а затем либо инактивировали нагреванием, либо разбавляли равным объемом 2x DNA / RNA Shield.Анализ РНК, очищенной с использованием набора для экстракции вирусной РНК QIAamp, не показал увеличения значения Cq с течением времени, что указывает на то, что вирусная РНК стабильна в течение по крайней мере 3 дней в растворе PK, даже в присутствии жидкости из носа человека (рис. 3D).

Мастер-микс с открытым исходным кодом, одноэтапная RT-qPCR для обнаружения SARS-CoV-2

Помимо наборов для очистки РНК, коммерческие мастер-миксы RT-qPCR являются дорогостоящим компонентом тестирования. Поэтому было бы полезно разработать мастер-микс для одностадийной ОТ-кПЦР, состоящий из самодельных, незапатентованных ферментов и недорогих буферных компонентов.После оценки различных ферментов и буферов наиболее достоверные результаты были получены при использовании комбинации обратной транскриптазы M-MLV (в частности, мутанта D524N с дефицитом РНКазы H [37]) и полимеразы Taq в буфере, содержащем высокую концентрацию трегалозы. Эта смесь, получившая название BEARmix (базовая экономичная реакционная смесь для амплификации), может быть легко приготовлена ​​непосредственно перед использованием путем добавления смеси ферментов к исходному раствору буфера и dNTP.

При использовании разведений in vitro РНК гена SARS-CoV-2, транскрибированной , и набора праймеров / зондов N2, наблюдалась ожидаемая лог-линейная зависимость между значением Cq и количеством введенной РНК (рис. 4A, верхняя панель).Предел обнаружения составлял приблизительно 50 молекул РНК на реакцию, поскольку амплификация постоянно наблюдалась для этого количества РНК, но не для меньших количеств (фиг. 4A, нижняя панель и S5 фиг.). Необработанные следы флуоресценции без вычитания фона демонстрировали медленное линейное увеличение базовой флуоресценции даже в отсутствие матрицы (S6 фиг.), Что может возникать в результате медленной деградации свободных олигонуклеотидов зондов под действием смеси ферментов. Таким образом, значения Cq были определены на основе второй производной интенсивности флуоресценции, на которую не влияет добавление линейного дрейфа базовой линии ([38]; см. Материалы и методы и S6 Рис.).

Рис. 4. «BEARmix»: одноступенчатый мастер-микс RT-qPCR с открытым исходным кодом.

(A) Верхняя панель: Стандартные кривые BEARmix с немодифицированной полимеразой Taq (синий) и сшитой формальдегидом полимеразой Taq горячего старта (красный). Линейная подгонка для BEARmix без горячего старта: Cq = 39,9–3,489x (коэффициент усиления 1,93), где x — логарифм с основанием 10 числа РНК на реакцию. Линейная подгонка для BEARmix с горячим запуском: Cq = 48,8–4,15x (коэффициент усиления = 1,74). Нижняя панель: фракция реакций, в которых не обнаружена амплификация (частота неудач) для каждой концентрации РНК.N = 24 реакции для 10-500 копий РНК, N = 8 реакций для 1000-106 копий. (B) Самодельная полимераза Taq с горячим стартом позволяет проводить реакцию при комнатной температуре. Реакции BEARmix были созданы с использованием немодифицированной (сшитой) полимеразы Taq с горячим стартом с 20 молекулами РНК N-гена на реакцию. Реакции проводили в термоциклере кПЦР после инкубации в течение 60 мин либо на льду, либо при комнатной температуре. В отличие от обычной полимеразы Taq, амплификация с помощью полимеразы Taq с горячим стартом не ингибируется инкубацией реакций в течение 60 мин при комнатной температуре перед запуском цикла RT-qPCR.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g004

Недостатком Taq-полимеразы дикого типа является то, что она может удлинять неправильно спаренные праймеры при комнатной температуре, производя продукты «димеры праймеров», которые конкурируют за амплификацию с целевой ампликон [39–41]. Чтобы преодолеть эту проблему, компании создали версии Taq-полимеразы «горячего старта», обычно путем включения в реакцию патентованных моноклональных антител или аптамеров, которые ингибируют полимеразу при низких температурах, но денатурируют при высокой температуре [39–41].Поскольку эти подходы дороги или защищены патентом, был оценен непатентный метод преобразования полимеразы Taq в версию с горячим запуском с использованием фиксации формальдегидом [42–44]. Обработка формальдегидом приводит к образованию поперечных связей внутри фермента, которые ингибируют его активность, в то время как инкубация при 95 ° C во время цикла ПЦР меняет поперечные связи для восстановления ферментативной активности. Полученную таким образом полимеразу Taq с горячим стартом сравнивали с несшитой полимеразой Taq в реакциях с РНК N-гена и набором праймер / зонд N1.Реакции инкубировали либо на льду, либо при комнатной температуре в течение различного времени после добавления праймера. Реакции, содержащие немодифицированную полимеразу Taq, показали существенное снижение амплификации после 10-минутной инкубации при комнатной температуре, а амплификация резко снизилась через 1 час при комнатной температуре (фиг. 4B, верхний ряд). Напротив, реакции, содержащие Taq-полимеразу с горячим стартом, показали амплификацию даже после 1-часовой инкубации при комнатной температуре (фиг. 4B, нижний ряд). Однако амплификация данного количества РНК с помощью полимеразы Taq с горячим стартом происходила на более позднем цикле, чем с обычной полимеразой Taq (рис. 4A и 4B).Это имело место в широком диапазоне входных концентраций РНК (рис. 4A), что может отражать неполную реактивацию фермента при нагревании при 95 ° C. В соответствии с этой интерпретацией эффективность амплификации, судя по наклону кривой зависимости Cq от концентрации РНК, была ниже для Taq горячего старта, чем для обычного Taq (коэффициент усиления 1,74 для Taq горячего старта по сравнению с 1,93 для немодифицированного Taq). . Увеличение времени стадии несшивания при 95 ° C до 15 или 20 минут привело к более ранней амплификации, однако амплификация со сшитым Taq все еще задерживалась по сравнению с несшитым Taq (S7 фиг.).Таким образом, сшивание Taq формальдегидом позволяет проводить реакцию при комнатной температуре, хотя и с пониженной эффективностью амплификации.

BEARmix использовали для выполнения RT-qPCR на оставшейся осажденной изопропанолом РНК из образцов тампона NP, которые были проанализированы ранее с использованием мастер-микса TaqPath (рис. 5A). Амплификация с зондами N1 и N2 наблюдалась в 6 из 9 положительных испытанных образцов, а амплификация наблюдалась с N2, но не с N1 для образца Pos12. Усиление не наблюдалось ни с N1, ни с N2 для образцов Pos3 и Pos4, которые ранее имели самые высокие значения Cq с мастер-миксом TaqPath.Ни один из 12 отрицательных образцов не показал амплификации с помощью N1 или N2, в то время как все положительные и отрицательные образцы показали амплификацию с помощью контрольного зонда РНКазы P (средний Cq 28,3, диапазон 25,4–31,0). Прямое добавление 0,5 мкл каждого образца мазка к 10 мкл реакции BEARmix дало амплификацию по крайней мере в одном из двух повторов для 10/12 положительных образцов и 0/12 отрицательных образцов (рис. 5B). Однако амплификация не удалась по крайней мере в одной реплике в трех положительных образцах, тогда как образцы Pos3 и Pos4 не смогли показать амплификацию ни в одной из реплик.Взятые вместе, эти результаты показывают, что RT-qPCR с BEARmix может обнаруживать SARS-CoV-2 в клинических образцах либо с использованием очищенной РНК, либо путем прямого добавления образцов мазков, хотя и с несколько меньшей чувствительностью, чем коммерческий мастер-микс TaqPath. Возможно, что деградация образца способствовала наблюдаемому снижению чувствительности в этом эксперименте, поскольку образцы РНК замораживали после анализа с помощью TaqPath, хранили при -80 ° C в течение 1 недели и размораживали для тестирования с помощью BEARmix.

Рис 5.Анализ клинических образцов с помощью BEARmix.

(A) Диаграмма разброса значений Cq из RT-qPCR образцов мазков NP, осажденных изопропанолом, с использованием BEARmix и TaqPath. Каждый кружок представляет собой среднее значение двух повторов для отдельного положительного образца с той же нумерацией, что и на предыдущих рисунках. Значения TaqPath Cq повторно построены с рисунков 1B и 1C. Undet., Неопределенное значение Cq (усиление не наблюдается). (B) Диаграмма разброса значений Cq для зондов N1 и N2 от прямого добавления 0,5 мкл клинических образцов мазка в UTM в 10 мкл реакции BEARmix.Каждая точка представляет собой среднее значение пары дубликатов КПЦР. C, D) Значения Cq РНК из положительных (красные точки) и отрицательных (синие точки) образцов клинических мазков NP, очищенных с помощью осаждения изопропанолом (C) или мини-набора QIAamp Viral RNA Mini (D) и проанализированных с помощью зонда N1 с BEARmix или TaqPath.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g005

Для дальнейшей оценки BEARmix были получены дополнительные 30 отрицательных и 30 положительных образцов мазков NP, которые хранили в 1x PBS + 1x DNA / RNA Shield.РНК экстрагировали либо с помощью осаждения изопропанолом, либо с помощью мини-набора QIAamp Viral RNA, и проводили RT-qPCR с использованием зонда N1 и BEARmix или TaqPath. Сильная корреляция наблюдалась между значениями Cq, полученными с использованием двух мастер-миксов (рис. 5C и 5D). Небольшая задержка в амплификации наблюдалась для BEARmix с использованием РНК, очищенной с помощью набора QIAamp (1,25 ± 0,14 цикла, среднее ± стандартная ошибка), а большая задержка наблюдалась для РНК, очищенной с помощью осаждения изопропанолом (3,17 ± 0,23 цикла, среднее ± стандартная ошибка).Амплификацию РНК, осажденной IPA, задерживали относительно РНК, очищенной QIAamp, на 2,70 ± 0,29 цикла для TaqPath и 4,50 ± 0,43 цикла для BEARmix. Некоторые из отрицательных образцов показали амплификацию в поздних циклах с использованием как TaqPath, так и BEARmix, что позволяет предположить, что низкие уровни перекрестного загрязнения могли иметь место на каком-то этапе обработки образца. Тем не менее, значения Cq положительных и отрицательных образцов в значительной степени различались. Используя наименьшее значение Cq из соответствующих отрицательных образцов в качестве порогового значения, амплификация наблюдалась в 28 из 30 положительных образцов с BEARmix + QIAamp, 27 из 30 положительных образцов с преципитацией BEARmix + IPA, 29 из 30 положительных образцов с TaqPath + QIAamp и 29 из 30 образцов с осаждением TaqPath + IPA.

Анализ искусственных мазков путем прямого добавления к мастер-миксу с открытым исходным кодом

Для оценки полного протокола, в котором образцы мазков собираются в раствор ПК и затем добавляются непосредственно в ОТ-ПЦР BEARmix, были приготовлены искусственные образцы мазков, в которых живой вирус смешивали с свободной от патогенов носовой жидкостью человека перед разбавлением в любой ДНК / RNA Shield, VCM (раствор для забора мазков на основе физиологического раствора Хэнкса от Quest Diagnostics, аналогичный VTM), содержащий 0.4 мг / мл протеиназы K или раствор 0,4 мг / мл протеиназы K в воде (рис. 6). Образцы в воде + PK и VCM + PK инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C, а затем инактивировали нагреванием при 75 ° C в течение 30 минут.

Рис. 6. RT-qPCR искусственных мазков.

Указанные количества , культивируемого in vitro SARS-CoV-2, были смешаны с растворами для сбора мазков, указанными в крайнем левом столбце, либо отдельно, либо в сочетании с человеческой носовой жидкостью. Образцы анализировали с помощью RT-qPCR с использованием BEARmix с набором праймеров / зондов N1 либо после экстракции РНК с помощью набора для очистки вирусной РНК QIAmp (синие ромбы), либо путем прямого добавления (красные кружки).Две реплики кПЦР показаны в отдельных вертикальных рядах для каждого условия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g006

Для оценки целостности РНК вирусную РНК экстрагировали из каждого образца с помощью набора для экстракции вирусной РНК QIAmp, а RT-qPCR выполняли с использованием праймера / зонда N1. смесь. Присутствие назальной жидкости не ингибировало амплификацию РНК для образцов в ДНК / РНК-щите или вода + PK (рис. 6, синие ромбы), что указывает на то, что вирусная РНК сохраняется в растворе PK в присутствии назальной жидкости.Однако более высокие значения Cq наблюдались в присутствии назальной жидкости в V-C-M + PK, что позволяет предположить, что РНК не сохраняется также в этом растворе в присутствии назальной жидкости.

Затем надуманные образцы мазков анализировали прямым добавлением к RT-qPCR. Как и в случае с образцами в UTM (рис. 2C), добавление более 1 мкл искусственного образца мазка в V-C-M + PK не дало более низких значений Cq, а вместо этого подавляло амплификацию (рис. 6, средний раздел, красные кружки). Напротив, добавление увеличивающихся количеств искусственного мазка в воде + PK привело к более низким значениям Cq (рис. 6, нижняя часть, красные кружки).Как и ожидалось, значения Cq были выше для прямого добавления искусственных образцов мазков, чем для очищенной концентрированной РНК. Таким образом, хотя прямое добавление образцов мазка в раствор PK обеспечивает несколько более низкую чувствительность, чем добавление очищенной концентрированной РНК, возможность добавления большего объема образцов в растворе PK улучшает обнаружение по сравнению с образцами в растворе VCM, подчеркивая ключевое преимущество этого метода. .

Обнаружение конечных точек с помощью флюоресцентного имидж-сканера

Термоциклеры кПЦР в реальном времени — дорогостоящие инструменты, которые некоторым испытательным центрам приходилось заимствовать у академических лабораторий [26].Однако стандартные термоциклеры относительно недороги и широко распространены, и были разработаны еще менее дорогие миниатюрные ПЦР-аппараты [45]. Визуальный осмотр изображений с помощью стандартного флюоресцентного гелевого имидж-сканера оценивался как средство различения присутствия или отсутствия вирусной РНК без считывания флуоресценции в реальном времени. Планшеты RT-qPCR из экспериментов на фиг. 2B, 1B и 1C были отображены на устройстве формирования изображений BioRad Chemidoc в каналах флуоресцеина (зонд TaqMan) и родамина (контроль нагрузки) (фиг. 7A и 7B).Лунки, в которых наблюдалась амплификация в режиме реального времени, демонстрировали заметно большую флуоресценцию в канале флуоресцеина по сравнению с лунками, в которых не было (рис. 7A и 7B). Точно так же визуализация в канале флуоресцеина четко отличила реакции BEARmix, содержащие 100 или 1000 -транскрибированных in vitro РНК гена N, от реакций отрицательного контроля без РНК (рис. 7C).

Рис. 7. Детектирование флуоресценции по конечной точке.

(A) Флуоресцентное изображение конечной точки планшета кПЦР, используемого для первых двух клинических образцов на рис. 1B и 1C.Показано 2-канальное наложение, в котором контрольный краситель ROX в мастер-миксе TaqPath появляется в канале родамина (красный), а продукт декантации FAM от зонда TaqMan появляется в канале флуоресцеина (голубой). Положительный контроль РНК гена N находится в правом нижнем углу. Положительные и отрицательные образцы четко различимы по флуоресценции в канале FAM. Обратите внимание, что оставлять пустые места между образцами было произвольным решением. B) Флуоресцентное изображение BioRad Chemidoc планшета для количественной ПЦР, используемого для реакций преципитации IPA и прямого добавления на фиг. 1B, 1C и 2B.Положительные и отрицательные образцы, различимые с помощью КПЦР, также можно различить с помощью флюоресцентной визуализации конечной точки. Красный, родамин (выдержка 0,5 с). Голубой, флуоресцеин (выдержка 0,05 с). Масштаб устанавливается от 0 до 55000 отсчетов для каждого канала. C) Обнаружение конечной точки с помощью набора датчиков N2 и BEARmix. Реакции проводили в чередующихся пробирках с водой (отрицательный контроль) или in vitro, транскрибированной РНК гена N, в количестве 100 или 1000 копий на реакцию. Изображение, полученное с выдержкой 0,1 с в канале флуоресцеина тепловизора ChemiDoc (BioRad), отображается с использованием цветовой карты Fiji «Green Fire Blue» с нижним и верхним пределами, установленными на 0 и 50000.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g007

Обсуждение

Приведенные выше результаты демонстрируют, что простые академические лабораторные методы выделения РНК, прямого добавления образцов и обнаружения ОТ-ПЦР предоставляют недорогие альтернативы использованию коммерческих наборов (рис. 8). Принятие этих методов может облегчить повсеместное тестирование с минимальными затратами.

Рис 8. Обзор вариантов тестирования.

Рабочие протоколы могут быть составлены из различных комбинаций сбора образцов, экстракции РНК, ОТ-ПЦР и методов обнаружения.На каждом этапе доступны экономичные альтернативы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.g008

Осаждение изопропанолом — чрезвычайно простой и недорогой способ извлечения и концентрирования РНК для обнаружения методом RT-qPCR (рис. 1 и 5C). Хотя в описанных выше экспериментах РНК концентрировалась от 2 до 8 раз, более высокая концентрация, вероятно, может быть достигнута путем увеличения количества вводимого образца мазка или уменьшения объема, в котором повторно растворяется осадок.Хотя выходы извлечения при осаждении изопропанолом были сопоставимы с показателями набора QIAamp Viral для очищенной РНК (рис. 1A), осаждение изопропанолом дало более высокие значения Cq, чем набор QIAamp, при тестировании с использованием образцов мазков NP в 1x PBS + 1x DNA / RNA Shield (рис. 5C и 5D). Другим недостатком этого метода является то, что аспирация супернатантов из отдельных пробирок требует много времени и требует низкой производительности по сравнению с методами на планшете (хотя на практике требует меньше времени, чем методы на основе коммерческих спин-колонок).Возможно, что осаждение образцов в 96-луночных планшетах и ​​удаление супернатанта с помощью многолуночного аспиратора может позволить обрабатывать большее количество образцов параллельно. Несмотря на эти недостатки, осаждение изопропанолом позволило выявить вирусную РНК в большинстве положительных тестируемых образцов (рис. 1C и 5C), сделав это возможным в качестве возможного варианта на случай непредвиденных обстоятельств, если коммерческие наборы недоступны или недоступны.

Прямое добавление образцов мазка к реакциям RT-qPCR экономит деньги и время за счет отказа от стадии очистки РНК.В соответствии с предыдущими исследованиями, приведенные выше результаты показывают, что можно обнаружить вирус, добавив небольшой объем инактивированного нагреванием образца мазка в UTM к RT-qPCR (рис. 2). Инкубация образцов мазков с протеиназой К до тепловой инактивации дала несколько более низкие значения Cq для обнаружения (рис. 2А). Интересно, что этот положительный эффект лечения PK не наблюдался для культивированного вируса (сравните фиг. 2A и 3B), возможно, отражая деградацию PK РНКаз или какого-либо другого ингибирующего белкового компонента, который присутствует в жидкостях человека, но не в супернатанте клеточной культуры.К сожалению, ингибирование RT-qPCR с помощью обычно используемых растворов для сбора мазков UTM и V-C-M ограничивает количество образца, которое может быть добавлено в реакцию, и, следовательно, чувствительность обнаружения (рис. 2C и 6). Приведенные выше результаты предполагают, что прямое добавление может быть облегчено за счет сбора мазков либо в буфере с низким содержанием соли, либо в воде, содержащей протеиназу K. Поразительно, что прямое добавление инактивированного нагреванием вируса в буфере с низким содержанием соли или воде дало значения Cq, близкие к ожидаемым, исходя из от общего числа копий РНК, что указывает на то, что амплификация RT-qPCR примерно так же эффективна для инактивированного нагреванием вируса, как и для очищенной вирусной РНК (рис. 3C).Метод прямого добавления был также эффективен для искусственных образцов мазков, содержащих культивированный вирус и человеческую назальную жидкость в воде + PK, и добавление большего объема образца обычно давало более низкие значения Cq (рис. 6). Этот метод также безопасен, поскольку вирус можно инактивировать нагреванием, не открывая пробирку (S3, рис.). В настоящем исследовании образцы были инактивированы нагреванием в течение 30 минут в соответствии с правилами биобезопасности, и возможно, что более короткие периоды времени будут эффективными, однако очень важно полностью инактивировать ПК, чтобы избежать ингибирования RT-qPCR.Даже с улучшенными буферами для сбора, конечно, существует ограничение на объем образца, который может быть добавлен за реакцию, и, таким образом, прямое добавление менее чувствительно, чем методы очистки, которые концентрируют РНК. Поэтому испытательные центры должны решить, стоит ли снижение чувствительности экономии времени и средств на метод прямого добавления.

Коммерческие мастер-миксы для одноэтапной RT-qPCR стоят до сотен долларов США за миллилитр. Результаты этого исследования показывают, что «BEARmix», простой мастер-микс лабораторного происхождения, способен обнаруживать десятки молекул РНК за реакцию.BEARmix производится с использованием обратной транскриптазы M-MLV и полимеразы Taq, которые легко очищаются с высоким выходом в любой лаборатории, оборудованной для биохимии белков. Версия BEARmix с горячим запуском может быть получена путем сшивания формальдегидом полимеразы Taq, однако это имеет недостаток, заключающийся в менее эффективной амплификации (Рис. 4A, 4B и S7, Рис.). BEARmix успешно обнаружил РНК SARS-CoV-2 в большинстве образцов мазков из NP, хотя, как правило, с более высокими значениями Cq, чем коммерческий мастер-микс TaqPath (рис. 5).Проверка BEARmix для клинической диагностики, конечно, потребует более подробного параллельного сравнения BEARmix и коммерческого мастер-микса в реальном испытательном центре, и вполне вероятно, что относительная производительность BEARmix и других мастер-миксов может отличаться в зависимости от праймера. набор использован [13]. Кроме того, было бы интересно оценить BEARmix в сочетании с протоколами прямого добавления для тестирования слюны [46, 47]. Этот базовый рецепт мастер-микса может быть улучшен различными способами, например, путем включения dUTP и UDG для предотвращения контаминации ампликонов, оптимизации условий для приготовления и реактивации Taq в горячем режиме или тестирования других вариантов ДНК-полимеразы и обратной транскриптазы общественного достояния [ 48].

Наконец, обнаружено, что конечные точки на флюоресцентном геле-имидж-сканере предоставляют еще один способ различения положительных и отрицательных образцов после ОТ-ПЦР. Учитывая, что целью тестирования является бинарное определение положительного / отрицательного статуса, а не абсолютное количественное определение РНК, анализ конечных точек такого рода потенциально может предоставить желаемую информацию без дорогостоящего прибора для ПЦР в реальном времени. В качестве альтернативы, возможно, может быть использован гибридный подход, в котором реакции проводятся на нескольких обычных термоциклерах с последующими измерениями конечной точки флуоресценции на термоциклере в реальном времени или флюоресцентном планшет-ридере.

Сильные стороны и ограничения исследования

Описанные здесь методы диагностики основаны на относительно недорогих, широко доступных материалах, а необходимые реактивы легко получить в академической лаборатории. Хотя описанный здесь мастер-микс лабораторного происхождения не так чувствителен и надежен, как коммерческие мастер-миксы, он успешно обнаружил вирусную РНК в большинстве протестированных клинических образцов и показал сильную количественную корреляцию с коммерческим миксом.Поскольку использование Taq-полимеразы без горячего старта требует, чтобы реакции готовились на льду, этот базовый рецепт может быть улучшен путем разработки недорогих методов для получения более надежных полимераз горячего старта. Осаждение изопропанолом представляет собой дешевую альтернативу коммерческим наборам для очистки РНК, однако оно требует утомительной ручной аспирации гранул РНК и, как было обнаружено, дает более высокие значения Cq для клинических образцов, чем современный коммерческий набор. Прямое добавление образцов мазка позволяет полностью избежать очистки РНК, что значительно упрощает протокол за счет снижения чувствительности.Важно отметить, что сбор мазков в растворе с низким содержанием соли может повысить чувствительность, позволяя добавлять больший объем образца для каждой реакции.

Заключение

Продолжение широкомасштабного тестирования на SARS-CoV-2 будет иметь решающее значение для сдерживания пандемии во время распространения вакцин. Это исследование демонстрирует, что относительно простые и недорогие методы могут использоваться для обнаружения SARS-CoV-2 в клинических образцах. Хотя эти подходы с открытым исходным кодом могут не соответствовать высокой чувствительности дорогих коммерческих наборов, центры тестирования должны учитывать, стоит ли некоторое снижение чувствительности увеличения доступности тестов перед лицом экономических и логистических ограничений.Дальнейшее совершенствование методов диагностики с открытым исходным кодом и их внедрение «всплывающими» центрами тестирования [26, 46, 47] может способствовать расширенному тестированию как в условиях текущей пандемии, так и в ответ на новые вирусы в будущем.

Дополнительная информация

S1 Рис. Анализ образцов мазков осаждением изопропанолом и прямым добавлением.

A) Сравнение значений Cq для образцов мазков, осажденных изопропанолом, проанализированных с помощью TaqPath + зонд N1, со средними значениями Ct из трех наборов зондов в предыдущей публикации [1].B) Прямое добавление различных количеств образца мазка (см. Рис. 2C). Указанные количества положительных образцов мазка 1 и 2 («Pos1» и «Pos2» выше) добавляли к 20 мкл TaqPath реакционной смеси, содержащей зонды N1, N2 и RP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s001

(TIF)

S2 Рис. Влияние добавок на TaqPath RT-qPCR. Значения

Cq показаны для 10 мкл реакций TaqPath, содержащих 5 × 10 ⁴ молекул in vitro -транскрибированной РНК гена N и 5 мкл указанных концентраций различных добавок.TX100, Тритон Х-100. НП-40, Nonidet P-40. Т20, Твин 20. ICA-630, Igepal CA-630. Сарк, саркозил (лауроилсаркозинат натрия). ДТТ, дитиотреитол.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s002

(TIF)

S3 Рис. Анализ цитопатического эффекта (CPE) для инактивации SARS-CoV-2.

Эксперименты по инактивации проводили в воде или растворе 2 (10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ EDTA, 0,5% Tween 20, 0,5 мМ DTT) с протеиназой K или без нее. Изображения были сделаны через 3 дня после инокуляции клеток Vero E6. без вируса (i), необработанный вирус (ii) или вирус инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C и 30 минут при 75 ° C в указанных растворах (iii-vi).Цитопатический эффект (ЦПЭ) был виден в культурах, инокулированных активным вирусом (ii), но не в культурах, инокулированных термоинактивированным вирусом (iii-vi).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s003

(TIF)

S4 Рис. Анализ активности протеиназы К.

SDS-PAGE реакций расщепления BSA с образцами протеиназы K, хранящимися в различных условиях в воде или растворе 2 (10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ EDTA, 0,5% Tween 20, 0,5 мМ DTT). Непереваренный БСА мигрирует при ~ 60 кДа («непереваренный»), в то время как протеолиз дает короткие переваренные полосы ≤ 30 кДа («переваренный»).Дорожки из разных гелей разделены пробелом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s004

(TIF)

S5 Рис. Кривые амплификации BEARmix для различных количеств входной РНК (относящиеся к рис. 4A).

Кривые для отдельных лунок показаны синим (верхний ряд; BEARmix без горячего старта) или красным (нижний ряд; горячий старт BEARmix). Средства показаны черным цветом. Каждый столбец соответствует разному (среднему) количеству молекул РНК на реакцию. Было выполнено линейное вычитание фона с использованием первых 15 циклов для определения дрейфа базовой линии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s005

(TIF)

S6 Рис. Метод второй производной для определения цикла количественной оценки (Cq).

Верхняя панель: Кривая флуоресценции для реакции BEARmix, содержащей 250 N молекул генов РНК, демонстрирующая медленный восходящий дрейф базовой флуоресценции до начала детектируемой амплификации. Средняя панель: производная интенсивности флуоресценции по отношению к номеру цикла, рассчитанная по скользящему окну ± 3 цикла.Нижняя панель: Вторая производная интенсивности флуоресценции, то есть производная кривой на средней панели. Вторая производная равна нулю во время начальной фазы линейного дрейфа базовой линии и достигает пика около начала детектируемого усиления. Красная вертикальная линия: значение Cq, определенное как центр параболической аппроксимации пика второй производной кривой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s006

(TIF)

S7 Рис. Влияние времени несшивания на активность Taq при горячем запуске.

Реакции BEARmix, приготовленные с Taq с горячим стартом (hsTaq), инкубировали в течение 10, 15 или 20 мин при 95 ° C для обращения формальдегидных поперечных сшивок перед циклами амплификации. Для обычного (несшитого) Taq использовали 5-минутную инкубацию при 95 ° C. Тонкие кривые представляют следы 7 отдельных реакций, а толстые кривые — их среднее значение. Более длительное время несшивания привело к более ранней амплификации, однако амплификация с Taq с горячим стартом все еще задерживалась по сравнению с немодифицированным Taq.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0246647.s007

(TIF)

S8 Рис. Очищенные ферменты.

Гель SDS-PAGE ДНК-полимеразы Taq и белков обратной транскриптазы M-MLV с конечной стадии очистки. Входящий белок представляет собой элюат с начальной стадии очистки Ni-NTA. FT, проточный. MW, молекулярная масса в килодальтонах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246647.s008

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Kaiser Permanente Healthcare и Федора Урнова за доступ к образцам мазков, Дирка Хокемейера за полезные обсуждения, лабораторию Tjian-Darzacq за ежедневные собрания Zoom и мозговые штурмы, Дэвида Лонга (Медицинский университет Южной Каролины) за советы по мастер-миксу и подготовка Taq при горячем запуске, а также Чипсу Хоаи, Лоре Флорес, Анне Маурер, Дагу Фоксу и Управлению по охране окружающей среды и безопасности Калифорнийского университета в Беркли за помощью в обеспечении биологической безопасности и соблюдении нормативных требований.

Список литературы

1. 1. Мервош С., Фернандес М. «Это как без тестирования»: результаты теста на коронавирус все еще задерживаются. Нью Йорк Таймс. 7 августа 2020 г. Доступно: https://www.nytimes.com/2020/08/04/us/virus-testing-delays.html
2. 2. Ларремор Д. Б., Уайлдер Б., Лестер Е., Шехата С., Берк Дж. М., Хэй Дж. А. и др. Чувствительность теста вторична по отношению к частоте и времени выполнения эпиднадзора за COVID-19. medRxiv Prepr Serv Heal Sci. 2020. pmid: 32607516
3. 3.Центры по контролю и профилактике заболеваний. CDC 2019-новый коронавирус (2019-nCoV) диагностическая панель RT-PCR в реальном времени для экстренного использования. Атланта; 2020.
4. 4. Akst J. Наборы для экстракции РНК для тестов на COVID-19 в США в дефиците. Sci. 2020. Доступно: https://www.the-scientist.com/news-opinion/rna-extraction-kits-for-covid-19-tests-are-in-short-supply-in-us-67250
5. 5 . Вон Дж., Ли С., Пак М., Ким Т.Ю., Пак М.Г., Чой Б.И. и др.Разработка безопасного для лабораторий и недорогого протокола обнаружения SARS-CoV-2 коронавирусной болезни 2019 (COVID-19). Exp Neurobiol. 2020; 29: 107–119. pmid: 32156101
6. 6. Guruceaga Xabier et al. Протокол быстрого обнаружения SARS-CoV-2 на основе преципитации РНК и RT-qPCR в образцах мазков из носоглотки. medRxiv. 2020. Доступно: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.26.20081307v1
7. 7. Понсе-Рохас Хосе Карлос и др. Быстрый и доступный метод выделения РНК, ДНК и белка для облегчения обнаружения SARS-CoV-2.bioRxiv. 2020. Доступно: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.29.178384v3.article-metrics
8. 8. Возняк А., Серда А., Ибарра-Энрикес С., Себастьян В., Армийо Г., Ламиг Л. и др. Простой метод подготовки РНК для обнаружения SARS-CoV-2 методом RT-qPCR. 2020. pmid: 33024174
9. 9. Эсбин М.Н., Уитни О.Н., Чонг С., Маурер А., Дарзак Х, Тьян Р. Преодоление узкого места в широкомасштабном тестировании: быстрый обзор подходов к тестированию на нуклеиновые кислоты для обнаружения COVID-19.РНК. 2020; 26: 771–783. pmid: 32358057
10. 10. Грант ПР, Тернер М.А., Шин Г.Ю., Настули Э., Леветт Л.Дж. Диагностика COVID-19 (SARS-CoV-2) без экстракции с помощью ОТ-ПЦР для увеличения возможностей национальных программ тестирования во время пандемии. bioRxiv. 2020. Доступно: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.06.028316v2
11. 11. Смирлаки И., Экман М., Лентини А., де Соуза Н.Р., Папаниколоу Н., Вондрачек М. и др. Массовое и быстрое тестирование на COVID-19 возможно с помощью ОТ-ПЦР SARS-CoV-2 без экстракции.medRxiv. 2020. Доступно: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.20067348v4 pmid: 32968075
12. 12. Арумугам А., Вонг С. Потенциальное использование необработанного образца для обнаружения COVID-19 с помощью RT-qPCR без этапа экстракции РНК. bioRxiv. 2020. Доступно: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.06.028811v1
13. 13. Алкоба-Флорес Дж., Гонсалес-Монтелонго Р., Иниго-Кампос А., де Артола Д.Г.-М, Хиль-Кампесино Н., Чуффреда Л. и др. Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 методом RT-qPCR в предварительно нагретых образцах мазков из носоглотки.medRxiv. 2020. Доступно: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.08.20058495v1 pmid: 324

14. 14. Fomsgaard AS, Rosenstierne MW. Альтернативный рабочий процесс для молекулярного обнаружения SARS-CoV-2 — уход от нехватки набора для экстракции NA. medRxiv. 2020. pmid: 322
15. 15. Хасан М.Р., Мирза Ф., Аль-Хайль Х., Сундарараджу С., Хаба Т., Икбал М. и др. Обнаружение РНК SARS-CoV-2 методом прямой RT-qPCR на образцах из носоглотки без экстракции вирусной РНК.Дарликс Ж.-ЛЕ, редактор. PLoS One. 2020; 15: e0236564. pmid: 32706827
16. 16. Бирнс С.А., Галлахер Р., Стедман А., Беннет С., Ривера Р., Ортега С. и др. Мультиплексная амплификация без экстракции для упрощенных тестов ОТ-ПЦР SARS-CoV-2. medRxiv. 2020.
17. 17. Брюс Э.А., Хуанг М.Л., Перчетти Г.А., Тиге С., Лаагиби П., Хоффман Дж. Дж. И др. ПРЯМОЕ ОТ-кПЦР-ОБНАРУЖЕНИЕ РНК SARS-CoV-2 ИЗ НАСОГОРИНГЕАЛЬНЫХ мазков пациента БЕЗ ЭТАПА ЭКСТРАКЦИИ РНК. bioRxiv. 2020. pmid: 32511328
18. 18.Мериндол Н., Пепин Дж., Маршан С., Рео М., Петерсон С., Пуарье А. и др. Обнаружение SARS-CoV-2 с помощью прямой rRT-PCR без экстракции РНК. J Clin Virol. 2020; 128: 104423. pmid: 32416598
19. 19. Marzinotto S, Mio C, Cifu A, Verardo R, Pipan C, Schneider C и др. Оптимизированный подход к быстрому обнаружению инфекции SARS-CoV-2 без выделения РНК. medRxiv. 2020. pmid: 33343767
20. 20. Beltrán-Pavez C, Márquez CL, Muñoz G, Valiente-Echeverría F, Gaggero A, Soto-Rifo R, et al.Обнаружение SARS-CoV-2 в образцах мазков из носоглотки без выделения РНК. bioRxiv. 2020. Доступно: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.28.013508v1.full
21. 21. Sentmanat M, Kouranova E, Cui X. Одностадийная экстракция РНК для обнаружения 2019-nCoV с помощью RT-qPCR. bioRxiv. 2020.
22. 22. Джунг Дж., Ладха А., Сайто М., Сегель М., Бруно Р., Хуанг М. В. и др. Тестирование на COVID-19 в местах оказания медицинской помощи с помощью диагностики SHERLOCK. medRxiv. 2020. pmid: 32511521
23. 23.Wee SK, Sivalingam SP, Yap EPH. Быстрый тест прямой амплификации нуклеиновой кислоты без экстракции РНК для SARS-CoV-2 с использованием портативного термоциклера для ПЦР. Гены (Базель). 2020; 11. pmid: 32570810
24. 24. Srivatsan S, Han PD, van Raay K, Wolf CR, McCulloch DJ, Kim AE и др. Предварительная поддержка протокола «сухой мазок без экстракции» для тестирования SARS-CoV-2 с помощью RT-qPCR. bioRxiv. 2020. pmid: 32511368
25. 25. Маллманн Л., Шалленбергер К., Демоллинер М., Эйзен АКА, Германн Б.С., Хельдт Ф.Х. и др.Предварительная обработка клинического образца протеиназой К позволяет обнаруживать SARS-CoV-2 в отсутствие экстракции РНК. bioRxiv. 2020. Доступно: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.07.083139v1
26. 26. Консорциум тестирования IGI. План для всплывающей лаборатории тестирования SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020; 38: 791–797. pmid: 32555529
27. 27. Чендлер-Браун Д., Буэно А.М., Атай О., Цао Д.С. Масштабируемый и быстро развертываемый анализ COVID-19 без экстракции РНК с помощью количественного секвенирования по Сэнгеру.bioRxiv. 2020.
28. 28. Kalikiri MKR, Hasan MR, Mirza F, Xaba T, Tang P, Lorenz S. Высокопроизводительная экстракция РНК SARS-CoV-2 из носоглоточных мазков с использованием твердофазных шариков для обратной иммобилизации. medRxiv. 2020.
29. 29. Zhao Z, Cui H, Song W., Ru X, Zhou W, Yu X. Простой метод извлечения вирусной РНК на основе магнитных наночастиц для эффективного обнаружения SARS-CoV-2. bioRxiv. 2020.
30. 30. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19) Разрешения на использование медицинских устройств в чрезвычайных ситуациях, EUA для диагностики in vitro.[цитировано 9 февраля 2020 г.]. Доступно: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas#individual-molecular
31. 31. Xu J, Wang J, Zhong Z, Su X, Yang K, Chen Z и др. Смеси для ПЦР, сохраняемые при комнатной температуре для обнаружения SARS-CoV-2. Clin Biochem. 2020. pmid: 325
32. 32. Мацумура Ю., Симидзу Т., Ногучи Т., Накано С., Ямамото М., Нагао М. Сравнение 12 анализов молекулярного обнаружения для SARS-CoV-2.bioRxiv. 2020.
33. 33. Бхадра С., Ридель Т.Э., Лахотия С., Тран Н.Д., Эллингтон А.Д. Изотермическая амплификация и обнаружение SARS-CoV-2 с высокой надежностью, в том числе с использованием сырых ферментов. bioRxiv. 2020.
34. 34. Bhadra S, Maranhao AC, Ellington AD. Одноферментный анализ RT-qPCR для SARS-CoV-2 и процедуры для производства реагентов. bioRxiv. 2020.
35. 35. Mascuch SJ, Fakhretaha-Aval S, Bowman JC, Ma MTH, Thomas G, Bommarius B и др. План для академических лабораторий по производству наборов для тестирования SARS-CoV-2 RT-qPCR.J Biol Chem. 2020. pmid: 32883809
36. 36. Doudna JA. План для всплывающей лаборатории тестирования SARS-CoV-2. 2020. Доступно: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.11.20061424v2
37. 37. Телесницкий А, Гофф СП. Мутации в домене РНКазы H влияют на взаимодействие между обратной транскриптазой вируса мышиного лейкоза Молони и его праймером-матрицей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 1276–80. pmid: 7679498
38. 38. Расмуссен Р. Количественная оценка на LightCycler.Быстрый цикл ПЦР в реальном времени. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg; 2001. С. 21–34. https://doi.org/10.1007/978-3-642-59524-0_3
39. 39. Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W. Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификации с низким числом копий. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 1717–23. pmid: 1579465
40. 40. Келлог Д.Е., Рыбалкин И., Чен С., Мухамедова Н., Власик Т., Зиберт П.Д. и др. Антитело TaqStart: ПЦР «горячий старт» с нейтрализующим моноклональным антителом, направленным против ДНК-полимеразы Taq.Биотехники. 1994; 16: 1134–7. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8074881 pmid: 8074881
41. 41. Dang C, Jayasena SD. Олигонуклеотидные ингибиторы ДНК-полимеразы Taq облегчают обнаружение мишеней с низким числом копий с помощью ПЦР. J Mol Biol. 1996; 264: 268–78. pmid: 8951376
42. 42. Иванов И., Лёфферт Д., Канг Дж., Риббе Дж., Стейнерт К. Метод обратимой модификации термостабильных ферментов. Соединенные Штаты; US6183998B1, 1998.
43. 43. Очистка Taq методом горячего старта.[цитировано 9 февраля 2020 г.]. Доступно: http://tfiib.med.harvard.edu/wiki/index.php/Hot_Start_Taq_Purification
44. 44. Дэвид Лонг, Медицинский университет Южной Каролины, личное сообщение.
45. 45. Гонсалес-Гонсалес Э., Трухильо-де-Сантьяго Г., Лара-Майорга И.М., Мартинес-Чапа С.О., Альварес М.М. Портативная и точная диагностика COVID-19: комбинированное использование термоциклера miniPCR и считывателя лунок для обнаружения вируса SARS-CoV-2. PLoS One. 2020; 15: e0237418.pmid: 327
47. 46. Vogels CBF, Brackney D, Wang J, Kalinich CC, Ott I, Kudo E, et al. SalivaDirect: простой и чувствительный молекулярный диагностический тест для эпиднадзора за SARS-CoV-2. medRxiv. 2020. Доступно: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.03.20167791v1
48. 47. Ranoa DRE, Holland RL, Alnaji FG, Green KJ, Wang L, Brooke CB и др. Молекулярное тестирование на основе слюны на SARS-CoV-2, которое позволяет избежать экстракции РНК. bioRxiv. 2020. pmid: 32607508
49. 48.Открытая лаборатория биоэкономики: открытая коллекция ферментов. [цитировано 9 мая 2020 г.]. Доступно: https://openbioeconomy.org/projects/open-enzyme-collections/

Руководство для новичков о преимуществах, где купить и как применять

Чистое тунговое масло — это олифа, получаемая из семян тунгового дерева, произрастающего в Китае и некоторых других азиатских странах. Масло веками использовалось в качестве водостойкого покрытия для лодок и других деревянных предметов, а также для отделки камня.Чистое тунговое масло — отличная альтернатива другим высыхающим маслам, таким как ореховое, льняное и соевое.

Помимо красивого и защитного покрытия, тунговое масло также является популярным выбором для проектов, поскольку оно универсально, легко в использовании и безвредно для окружающей среды. Если вы хотите узнать больше о тунговом масле и о том, как его использовать, то вы попали в нужное место!

Основные преимущества использования тунгового масла в качестве отделочного покрытия

Есть много причин, по которым люди любят тунговое масло в своих проектах, и одна из самых популярных — это его гибкое, долговечное, безопасное для пищевых продуктов и защитное водонепроницаемое покрытие, которое не плесневеет, не темнеет и не прогоркнет.С практической точки зрения тунговое масло сохнет быстрее, чем другие масла, что упрощает его нанесение и сокращает время его нанесения. С эстетической точки зрения тунговое масло также обеспечивает красивую матовую поверхность, которая придает глубину текстуре древесины, создавая античный вид на любой поверхности.

Разница между чистым и темным тунговым маслом

Как следует из названия, чистое тунговое масло не содержит добавок и дистиллятов, что означает, что оно не создает глянцевого или тяжелого покрытия. Чистое тунговое масло при высыхании приобретает медовый цвет.Единственное отличие от темного тунгового масла заключается в том, что мы добавили неканцерогенный и не содержащий ПХБ смолистый углеводород, который придает маслу более темный и насыщенный оттенок.

Многочисленные применения тунгового масла

Плотники, плотники, мастера и любители — все любят тунговое масло, и на протяжении многих лет они использовали его в качестве красивой и защитной отделки на большом количестве проектов и поверхностей. Например, тунговое масло с фантастическими результатами использовалось для отделки деревянных, бамбуковых, бетонных, каменных, кирпичных и даже металлических поверхностей.Тунговое масло является фаворитом для отделки деревянных полов, краснодеревщиков, террас, сайдинга, мебели, гитар и других музыкальных инструментов, игрушек ручной работы и многого другого. Если вам интересно, подходит ли это масло для дерева для вашего проекта, то, вероятно, так оно и есть!

Сколько вам нужно для вашего проекта?

Галлон тунгового масла покроет 400 квадратных футов поверхности. В зависимости от пористости поверхности может потребоваться до 5 слоев. Например, чтобы покрыть площадь в 400 квадратных футов, вам потребуется чуть более 2 галлонов масла и растворителя (для разбавления) или 5 галлонов наших предварительно разбавленных вариантов.

1. Очистите поверхность

Правильное нанесение тунгового масла зависит от того, начинаете ли вы с чистой и подготовленной поверхности. Перед тем как начать, убедитесь, что на поверхности нет жира, масла, грязи, пыли или других загрязнений.

Если необходимо, начните с шлифовки или зачистки поверхности, чтобы удалить уже имеющееся покрытие или отделку. Тунговое масло можно наносить только на голые поверхности или поверх другого слоя тунгового масла. Затем очистите поверхность тринатрийфосфатом.Отшлифуйте поверхность еще раз наждачной бумагой с зернистостью 150, а затем тщательно пропылесосьте, чтобы удалить всю пыль.

2. Разбавить масло

Разбавитель облегчит нанесение тунгового масла, быстрее высохнет и улучшит проникновение. Единственный случай, когда вы не должны предварительно разбавлять масло, — это если вы наносите его на обветренное дерево, бетон, старые и необработанные деревянные полы или другие сильно впитывающие поверхности. Чтобы разбавить масло, смешайте его с равными частями Citrus Solvent, уайт-спирита или уайт-спирита перед нанесением.Вы также можете выбрать один из наших предварительно разбавленных вариантов, Half & Half или Dark Half, чтобы использовать прямо из бутылки!

3. Обильно нанесите первый слой

.

Масло можно наносить кистью с натуральной щетиной, губкой или мягкой безворсовой тряпкой. Обильно нанесите масло на поверхность. В отличие от лака, который наносится на древесину, тунговое масло имеет целью полностью пропитать клетки древесины. Когда вы нанесли первый слой, дайте маслу впитаться.

4.Нанести последующие слои

После впитывания первого слоя нанесите второй слой. Продолжайте этот процесс нанесения слоев, при необходимости подождите 40 минут между слоями, пока более 80 процентов поверхности не станет глянцевой в течение как минимум 40 минут. Это означает, что клетки древесины пропитались, и вы можете переходить к следующему шагу. Для декоративных предметов может потребоваться от двух до четырех слоев, в то время как функциональные поверхности, которые будут обрабатываться, использоваться или ходить, потребуется как минимум от трех до пяти.

5.Удаление неабсорбированного масла с поверхности.

После того, как вы нанесли несколько слоев и дерево перестало впитывать масло, протрите поверхность чистой тряпкой. Если на поверхности остались лужи масла, вытрите их тряпкой. Это важно, поскольку вы не хотите, чтобы тунговое масло начало застывать на поверхности.

На этом этапе ваша поверхность полностью насыщена. Однако чистое тунговое масло оседает внутри древесины / материала в течение ночи и на следующий день. Для достижения наилучшего результата мы рекомендуем нанести еще один или два слоя масла, следуя ранее указанным инструкциям, после этого периода ожидания.Обязательно вытрите масло, которое не впитывается на поверхности. Перед утилизацией тряпки, пропитанные маслом, вывешивайте их на улице, чтобы они высохли.

6. Дайте маслу застыть в течение 30 дней

Отсюда маслу потребуется от недели до 10 дней для начала отверждения и от 15 до 30 дней для полного отверждения. Не оставляйте смазанный тунговым маслом объект на длительное время под прямыми солнечными лучами. В течение первых 10 дней отверждения проверьте и вытрите тунговое масло, которое может просочиться на поверхность. В течение этого времени вы можете ходить по полу в чистой обуви, но не ставьте на пол тяжелые предметы и не ходите по нему в грязной обуви.(Совет: кладите старую тряпку под обувь, чтобы ходить по поверхности, независимо от того, в какой обуви вы носите.) Никаких других герметиков или защитных продуктов поверх масла не требуется. Он естественным образом изолирует, водонепроницаем и защищает ваши поверхности!

7. Очистка поверхностей

Чистое тунговое масло легко чистить! Для чистки полов или других деревянных предметов просто используйте горячую воду и обычное мыло для посуды. Вот и все!

8. При необходимости нанесите повторно, чтобы оживить и обеспечить дополнительную защиту

Поверхности, которые часто используются или по которым часто ходят, могут нуждаться в некотором уходе, чтобы восстановить их внешний вид и повысить защиту.Для этого просто смешайте 2 части разбавителя с 1 частью тунгового масла и протрите поверхность. Дайте время высохнуть по мере необходимости.

Чистое тунговое масло пользуется популярностью на протяжении тысяч лет благодаря защитному и водонепроницаемому покрытию, которое оно создает на древесине и других пористых поверхностях. В наши дни чистое тунговое масло также набирает обороты, потому что оно нетоксично, безвредно для окружающей среды и безопасно для пищевых продуктов, а это означает, что оно идеально подходит для кухонной посуды, мясных блоков, разделочных досок, столешниц и даже игрушек!

Наносить тунговое масло просто и эффективно! Основные советы, которые следует запомнить: не оставляйте лишнее масло на поверхности во время фазы отверждения, не нужно шлифовать между слоями, не требуются другие герметики или финишные покрытия и используйте 2 части разбавителя на 1 часть тунгового масла для ухода.

Миф: Тунговое масло — недавняя находка, появившаяся на рынке только в 1960-х годах.

Факт: Тунговому маслу тысячи лет.

Многие люди думают, что тунговое масло появилось только в 1965 году, когда Гомер Формсби выпустил на рынок свой особый состав на основе тунгового масла. Хотя мы, несомненно, многим обязаны Формсби за популяризацию этого невероятного масла, его продукт был небольшим переизобретением масла, впервые обнаруженного в трудах Конфуция еще в 500 году до нашей эры. Есть причина, по которой тунговое масло также называют китайским древесным маслом.Китайцы давно используют тунговый орех как средство от множества недугов, а также как средство для гидроизоляции своих лодок ручной работы. Сегодня мы можем использовать этот древний «секрет», чтобы придать всем видам изделий из дерева и модернизированной мебели новый великолепный вид.

Миф: Тунговое масло никогда не сохнет, и с ним очень сложно работать.

Факт: Тунговое масло сохнет долго, но сохнет.

Хотя это правда, что тунговому маслу требуется немного больше времени для высыхания, чем меньшему количеству масел, и вам нужно приложить немного больше усилий для достижения идеальной отделки, все это время на передней части означает долговечный и более блестящий результат. вы будете наслаждаться на долгие годы.Помните, что быстросохнущие масла не оставляют вам времени на исправление ошибок, и это создает большие трудности, когда вы цените качество выше скорости.

Миф: Нет причин покупать тунговое масло, если я могу купить кипяченое льняное масло (BLO) за меньшие деньги.

Факт: Чистое тунговое масло чистое, не обесцвечивается и обладает множеством других преимуществ, которых нет у BLO.

Если вы обрабатываете семена льна, вы получаете льняное масло, соединение с легендарной историей, почти такое же, как у тунгового масла, но сравнения на этом заканчиваются.Хотя льняное масло может быть дешевле, в него также добавлены соединения металлов, и оно быстрее сохнет. Последнее может показаться хорошей идеей, но из-за этого может быть труднее добиться ровного финиша, если вы не настроены работать в бешеном темпе.

BLO также склонен к пожелтению с возрастом и может прогоркнуть или даже вызвать плесень. С другой стороны, тунговое масло сохраняет некоторую гибкость при затвердевании — идеально для деревянных швов и т.п. — и обладает гидроизоляционными качествами, которые сохранят вашу красивую отделку нетронутой.

Миф: Тунговое масло — опасный выбор для всех, кто страдает аллергией на орехи.

Факт: Не обязательно, потому что орехи на самом деле не орехи!

Тунговые орехи на самом деле являются семенами внутри плодов тунгового дерева. Они попадают в категорию, называемую «костянки», в которую также входят другие мясистые плоды, окружающие «косточку» или очищенные от скорлупы семена, такие как вишня, сливы, персики и даже миндаль и орехи пекан. Нет ничего необычного в том, что человек, страдающий аллергией на древесные орехи, прекрасно переносит употребление костянок.Между прочим, арахис технически относится к бобовым. Даже если вы не можете есть арахисовое масло, вы можете безопасно наслаждаться кокосом, персиками, фисташками и, да, даже тунговыми орехами и полученным маслом.

Чтобы получить дополнительную информацию или купить Pure Tung Oil, посетите Real Milk Paint онлайн или позвоните нам по телефону 800-339-9748.

Herald Journal Newspaper Photographs, 1969–1996

Ящик
5	05:01: Провиденс: призыв (объединенный)	(год?) 1 октября
5	05:02: Провиденс: Продовольственная ярмарка	1970
5	05:03: Провиденс: школа	1969–1985
5	05:04: Провиденс: победители школьных сочинений	1972 5 мая
5	05:05: провидение: каток	Декабрь 1971 г.
5	05:06: Провидение: кол, Скиния Логана	1969–1985
5	05:07: Провиденс: ужин из индейки и квашеной капусты	1973 Январь
5	05:08: Премия беатификации Провиденс	1973 17 сентября
5	05:09: Член городского совета Провиденса	1972 Январь
5	05:10: РАО	1969–1985
5	05:11: Р.Джеймс Ко.	1969–1985
5	05:12: Клиника бешенства	1969–1985
5	05:13: Картинки дождливого дня	1969–1985
5	05:14: Недвижимость: Совет директоров риэлторов	1973 ноябрь
5	05:15: Недвижимость: строительство кондоминиума, 3-я Запад между 3-м и 4-м севером	1969–1985
5	05:16: Недвижимость: новостройки	1973 Январь
5	05:17: Переработка: проект по переработке пивных банок	1969–1985
5	05:18: Красный Крест	1969–1985
5	05:19: Красный Крест: Blood Mobile, УрГУ	1973 март
5	05:20: Красный Крест: Blood Mobile, USU	1969–1985
5	05:21: Склад Ривза	1971
5	05:22: Республиканские мероприятия	1969–1985
5	05:23: кандидаты от республиканцев	1969–1985
5	05:24: Республиканский съезд: Логан	1973 Апрель
5	05:25: Республиканский съезд: Солт-Лейк-Сити	1970 июль
5	05:26: Конгресс округа республиканцев	1969–1985
5	05:27: Конгресс округа республиканцев	1973 14 апреля
5	05:28: Республиканский банкет в День Линкольна: США	1972 22 февраля
5	05:29: Республиканская партия: встречаются кандидаты Республиканской партии, Sky Посмотреть среднюю школу	1972 3 июня
5	05:30: Республиканцы: знакомство женщин-республиканцев старшеклассников с голосованием	1971 29 апреля
5	05:31: Ричардс, ЛеГранд: большое колесо мормонов	Март 1971 года
5	05:32: Ричмонд: черно-белые дни	1969 Май
5	05:33: Ричмонд: черно-белые дни	1971 22 мая
5	05:34: Ричмонд: черно-белые дни, KSL Calf Конкурс	1971 22 мая
5	05:35: Ричмонд: черно-белые дни	1972 Май
5	05:36: Ричмонд: черно-белые дни	1973 Май
5	05:37: Ричмонд: черно-белые дни, конное шоу	1969–1985
5	05:38: городской совет Ричмонда	1969–1985
5	05:39: Городской совет Ричмонда: Ди Блэр, член совета; Ламар Спакман, член совета; ГРАММ.Э. Меррилл, член совета; Стивен Эриксон, член совета; Ричард Бэгли, мэр.	1973 2 февраля
5	05:40: Ричмонд: подписание займа FHA	1972 12 мая
5	05:41: Ritewood Poultry	1973 25 сентября
5	05:42: Ривер-Хайтс	1969–1985
5	05:43: Ривер-Хайтс: комиссар Джойс Миллер	(год?) 4 ноября
5	05:44: Городской совет Ривер-Хайтс: (слева направо) Веан Постма, мэр; Эрвин Кросби, клерк; Рекс Нильсон, член совета; Брандт Гессель, член совета; Джойс Миллер, член совета; Кен Соренсон, член совета; Джозеф Блэк (отсутствует), член совета	1973 13 февраля
5	05:45: Школа River Heights: скакалка, воздушные змеи и мрамор.Марблз — Билли Уэстон, шестой, M&M Данфорд Уэстон; Дон Хатсон, 1-е место — M&M Tom; Чак Кэнтуэлл, 4-е место, Джуди Кэнтуэлл; Роб Уилсон, 4-й, M&M Тед	1969–1985
5	05:46: Школа Ривер-Хайтс: музыкальная оперетта. Холли Биндрап, Линда Микельсон, Ян Гарретт, Мари Холл, Майк Белнап, Шона Рингер, Кевин Симмонс, Нефф Бродбент, Алан Эдвардс, Рэнди Фулмор, Джилл Олсен, Рэй Смит, Линн Янг, Брайан Хаятт, Пол Гарнер, Росс Миллер, Пол Дэвис, Кэти Хамфри и Ребекка Дженсен	1969–1985
5	05:47: Робинзон и группа: Отто Дерр, Ф.Грег Робинсон (менеджер) и Джек Хатчисон (региональный директор)	(год?) 4 октября
5	05:48: Скалолазание: падение в Логан-Каньон	1973 26 сентября
5	05:49: Рок-клуб	1969–1985
5	05:50: Рок-хаунт-шоу	1972 Апрель
5	05:51: Родео Роялти	1971
5	05:52: Роликовые рапсодии	1969–1985
5	05:53: Роликовые рапсодии	1969–1985
5	05:54: Роликовые рапсодии	1972
5	05:55: Шкиперы каната: спиннинг.Тэмми Джейкобсон (в свитере), родители Cal J .; Пенни Дале (старшая девочка) и Шэрон Дале (маленькая девочка), родители Вэл Д.	1969–1985
5	05:56: Ротари клуб	1969–1985
5	05:57: Ротари-офицер	1972
5	05:58: Ротари офицеры	1973 март
5	05:59: Школьные автобусы	1973 14 октября
5	05:60: Школа медико-стоматологических технологий: Эбелинг.Артериальное давление — Энн Доусон (ученица), Терри Ричмонд (учитель), и Янис Ларсон (студентка). Дентал-Кароли Хирши (студентка), Крис Грессвелл (учитель) и Бекки (ученица)	1969–1985
5	05:61: Сирс, Бекки: победитель конкурса	1969–1985
5	05:62: Тур для пожилых людей: 81 Запад 2-й Север	(год?) 16 июля
5	05:63: Пенсионеры: Бриджерленд	1973 11 октября
5	05:64: Новаторский подход к пожилым людям: Бриджерленд подиатрия	1973 12 октября
5	05:65: Премия журнала Seventeen: 1-е, 3-е и Награды «Почетное упоминание».(Слева направо) Барбара Саммерс, Диллин Хамфриз и Алиса Браун	1969–1985
5	05:66: Покупки: обратно в школу	1970
5	05:67: Тротуарный базар	1970 июль
5	05:68: Тротуарный базар	1971
5	05:69: Тротуарный базар	1972 июль
5	05:70: Тротуарный базар	(год?) 21 июня
5	05:71: Серебряный бобер: Олень (?) Награды, УрГУ	2 февраля 1972 г.
5	05:72: Дайвинг	1973 сентябрь
5	05:73: Катание на лыжах: потерянные лыжники в Бивер-Маунтин	1969–1985
5	05:74: Скунс: потерянный скунс	1971
5	05:75: Средняя школа Sky View	1969 Август
5	05:76: Средняя школа Sky View	1971–1971
5	05:77: Средняя школа Sky View	1972
5	05:78: Средняя школа Sky View: Аг, штат представитель Д.С.	1969–1985
5	05:79: Средняя школа Sky View: группа возвращается из Калгари	1972 15 июля
5	05:80: Средняя школа Sky View: пожертвование книг от Канада	1973 Май
5	05:81: Sky View High School: бизнес-практика, Здание профессионального обучения, Зал мисс Вильма	1969–1985
5	05:82: Средняя школа Sky View: радость и песня лидеры	1969–1985
5	05:83: Средняя школа Sky View: группа поддержки	1971-1972
5	05:84: Средняя школа Sky View: группа поддержки	1972
5	05:85: Средняя школа Sky View: группа поддержки	1973 28 сентября
5	05:86: Средняя школа Sky View: группа поддержки	1973 8 октября
5	05:87: Средняя школа Скай Вью: консультанты	1969–1985
5	05:88: Средняя школа Sky View: кросс-кантри пригласительный	1969–1985
5	05:89: Средняя школа Скай Вью: Хранитель-Хайден	(год?) 21 декабря
5	05:90: Средняя школа Sky View: DECCA (национальная).Розали Бэк, Клейн Лихти, Дуг Хэтч, Дэйв Зиллис и Грант Бро	1969–1985
5	05:91: Средняя школа Sky View: класс дебатов	Октябрь 1971 г.
5	05:92: Средняя школа Sky View: дискуссионная группа	1972
5	05:93: Средняя школа Sky View: распределительное образование, Джон Шилдс и Грант Бро	16 марта 1972 г.
5	05:94: Средняя школа Sky View: обучение водителю.Джули Экстром (Ричмонд), Шона Керр (Велсвилл), Сет Моэн и МэриЭнн Фанк (Ричмонд)	1969–1985
5	05:95: Средняя школа Sky View: FFA	1969–1985
5	05:96: Средняя школа Sky View: чемпионаты FFA	1973 22 октября
5	05:97: Средняя школа Sky View: общественное питание (напротив кафетерия), миссис А.Класс Рейнольдса	1969–1985
5	05:98: Средняя школа Sky View: футбол — Sky View и Box Elder	1973 сентябрь
5	05:99: Sky View High School: иностранный язык учителя. Мардж Андер, Леон Освальд и Элдон Шварц	1969–1985
5	05: 100: Средняя школа Sky View: победители конкурса судебной экспертизы	1969–1985
5	05: 101: Средняя школа Sky View: большинство на крыльце Офицеры.Даррелл Симмонс, президент и ведущий директор; Холли Моффитт; Жан Ройланс, хореограф; Грир Бэрд, хореограф	1969–1985
5	05: 102: Средняя школа Sky View: Девушка недели	1969–1985
5	05: 103: Средняя школа Sky View: команда по гольфу	1973 20 сентября
5	05: 104: Средняя школа Скай Вью: Скай Вью Хай Выпускной	1972
5	05: 105: Средняя школа Sky View: выпускной подготовка.1-й ряд — Кристен Андер, Леон Спакман, Грег Линдли, Ларлен Эк и Колетт Петерсон. 2-й ряд — Джей Нильсен, Брент Хэдфилд, Фэй Гриффин, Д. Саттон Тейн, Жанетт Аллен, Пола Уилсон, Кирк Стросен и Терри Талбот.	1969–1985
5	05: 106: Средняя школа Sky View: класс домашнего строительства	1969–1985
5	05: 107: Средняя школа Sky View: возвращение домой, Смитфилд	Октябрь 1971 г.
5	05: 108: Средняя школа Скай Вью :, Возвращение домой	21-22 сентября, г. 1972
5	05: 109: Средняя школа Скай Вью: Возвращение домой деятельность	1973 28 сентября
5	05: 110: Средняя школа Sky View: Возвращение домой Queen Дебби Баллам	1971
5	05: 111: Средняя школа Sky View: оценка домашнего скота команда	1969–1985
5	05: 112: Средняя школа Sky View: современный танец, миссис.Хобсон. Тана Ларсен, (слева) Ронда Козенс и (справа) Терри Талбот. Назад- Джули Дженкинс, Венди Гриффин и Линда Эшкрофт. Фронт-Крис Нильсон и Хелен Хуррен. Топ-Энн Бэр и Бет Энн Миллер.	1969–1985
5	05: 113: Sky View High School: мюзикл, актерский состав лидеры, 5 января.Кэй Ларсен, Хайрам; Джим Кирби, Хайрам; Дебби Холл, Ривер-Хайтс; Леон Спакман, Льюистон	1969–1985
5	05: 114: Средняя школа Sky View: Национальная честь Общество	1969–1985
5	05: 115: Средняя школа Sky View: детские сады, миссис Снэпп.Дайан Белл, Сэнди Роу, Крис Мюррей (студент, живущий дома) и Кэрри Янсси	1969–1985
5	05: 116: Sky View High School: физическая культура	(год?) 12 января
5	05: 117: Средняя школа Sky View: портретный дисплей в библиотека.Ариэль Бенсон, Чак Хейлз и Джефф Кендрик	1969–1985
5	05: 118: Средняя школа Sky View: специальное образование, Уильям Ригби. Миссис Сьюзан Карлсон, мистер Уильям Ригби и миссис Мэдж Мейер	1969–1985
5	05: 119: Средняя школа Sky View: победители выступления.(Слева направо) Сидящие Розмари Джонсон, Джерри Ларсон и Крис Марлер. Стэндинг-Дуг Хэтч, Филлис Уоткинс и Майк Рибик	1969–1985
5	05: 120: Средняя школа Sky View: Sportsmanship Trophy презентация	1973 март
5	05: 121: Средняя школа Sky View: театр	1971
5	05: 122: Средняя школа Sky View: театр	1969–1985
5	05: 123: Средняя школа Sky View: театр	1973 ноябрь
5	05: 124: Средняя школа Sky View: Vistauns	1969–1985
5	05: 125: Средняя школа Sky View: Vistauns	1972 26 января
5	05: 126: Средняя школа Sky View: Vistauns	1972 Май
5	05: 127: Средняя школа Sky View: Vistauns	1973–1974
5	05: 128: Средняя школа Sky View: конкурс сочинений	Декабрь 1971 г.
5	05: 129: Смитфилд	1973 Январь
5	05: 130: Смитфилд: горение городской свалки	1972 17 октября
5	05: 131: Смитфилд: Кровля мэрии	1973 17 июля
5	05: 132: Smithfield: животноводческий аукцион	1969–1985
	05: 133: Смитфилд: кандидат в мэры	1973 Октябрь
Ящик
5	05: 134: Смитфилд: парадный бросок 1: 4 Теода Даунс, 5-8 Sky View High School Band, 9-11 Smithfield, 12-15 детей из Smithfield School, 16 Smithfield Dairy Princess, 17 Ричмонд, 18 неизвестно, 19-21 ребенок на параде	1972 13 мая
5	05: 135: Смитфилд: парадный бросок 2:20 Парадайз, 21 Престон младшийСредняя школа, 22 Средняя школа Престона младшего, 23 Wellsville, 24 Нибли, 25 Oneida Co., 26 West Side High School, Дейтон, Айдахо, 27 Кларкстон, 28 Льюистон, 29 ВЕРХОВ, 30 старинных автомобилей, 31 старинных автомобилей, 32 Трентон, 33 Трентон, 34 Мендон, 35 Мендон, 36 Логан, учение средней школы Команда, 37 Группа тренировок средней школы Логана и группа, 38-40 Средняя школа Логана Группа	1972 13 мая
5	05: 136: Смитфилд: парадный бросок 3:19 Мисс Округ Франклин, 20 Мисс Франклин, 21 Гайд-Парк, 22 Смитфилд 3-й приход, 23 Rotary Dairy Princess, 24 Logan Kiwanis Princess, 25 Logan Городская и Тайная палата, 26 Логан-Сити и Тайная палата, 27 Престон, Айдахо 6 класс, 28 Бенсон, 29 Провиденс, 30 Миллвилл, 31 Смитфилд 4-H, 32 Cache County Jeep Patrol, 33 Cache County Mounted Sheriff’s Posse, 34 Cache County Mounted Sheriff’s Posse	1972 13 мая
5	05: 137: Городской совет Смитфилда: (слева направо) Роберт Тулсон, член совета; Роберт Чемберс, член совета; Орал Баллам, мэр; Член Совета Дона Дейли, Эллис Джонас (отсутствует), член Совета; Глен Оливерсон, член совета	1973 10 февраля
5	05: 138: Регистрация снегохода	1972 Январь
5	05: 139: Карточка социального обеспечения: самый молодой владелец в U.С.	1969–1985
5	05: 140: Социальные службы	1969–1985
5	05: 141: Сыны пионеров Юты (SUP): R.V. Дженсен Историческая ферма, Марвин Э. Смит, бывший комендант М. Бэт; Гарольд Х. Дженсен, Natl.Hist. КАК ДЕЛА; Грант Орсенбах, Sierra Chapter SUP; Доктор Чейз	11 сентября 1971
5	05: 142: Клуб сороптимистов	1969–1985
5	05: 143: Сороптимисты	1969–1985
5	05: 144: Звуки Сиона: офицеры, танцоры и индивидуальные группы	1972
5	05: 145: Звуки Сиона Хор	1973 март
5	05: 146: Саут-Кэш-младший.Средняя школа	1969–1985
5	05: 147: Средняя школа Саут-Кэш-младший	1969–1985
5	05: 148: Средняя школа Саут-Кэш-младший: концерт группы	1969–1985
5	05: 149: Саут-Кэш-младший.Средняя школа: чирлидеры, Линн Хант	1969–1985
5	05: 150: Средняя школа Саут-Кэш-младший: класс (история?)	1969–1985
5	05: 151: Средняя школа Саут-Кэш-младший: класс офицеры, парадная лестница, 7-й класс: Ричард Спулер, Луз Хилл и Марк Ходфилд.Чемодан с трофеями, 8-й класс: Тодд Уильямс, Кэрол Смарт и Брент. Поульсен. Фонтан, 9 класс: Вэл Ганнелл, Синди Эрл и Джед Мюррей	(год?) 13 октября
5	05: 152: Средняя школа Саут-Кэш-младший: математика (индивидуально), Спенс Уорд и Ричард Каммак	1969–1985
5	05: 153: Саут-Кэш-младший.Средняя школа: Old Fashion дней	1973 Январь
5	05: 154: Средняя школа Саут-Кэш-младший: PTA	1969–1985
5	05: 155: Средняя школа Саут-Кэш-младший: чтение программа	1969–1985
5	05: 156: Саут-Кэш-младший.Средняя школа: класс естественных наук исследование погоды. Марк Л. Годфри, Клер Нильсен (Провиденс) и Брэд Паркинсон (Уэллсвилл) — 8 класс	1969–1985
5	05: 157: Средняя школа Саут-Кэш-младший: научная ярмарка	1972 Май
5	05: 158: Саут-Кэш-младший.Средняя школа: семинар участников	1969–1985
5	05: 159: Средняя школа Саут-Кэш-младший: семинария Walk-a-Thon	1969–1985
5	05: 160: South Cache Jr. Средняя школа: ученица учителя	1969–1985
5	05: 161: Саут-Кэш-младший.Старшеклассник учителя	1972 Январь
5	05: 162: South Cache Jr. Средняя школа: ученица учителей, Дженис Робертс, Найда Годвин и Мередит Джастенсен с студенты Тила Дрейни и Ким Ропелато	(год?) 13 октября
5	05: 163: Саут-Кэш-младший.Высшая школа: театр им. Выкуп Красного Вождя «	1973 6-8 ноября
5	05: 164: Спонсор недели	1969–1985
5	05: 165: Спортивное шоу: Солт-Лейк-Сити	1969–1985
5	05: 166: Спортсмен	1969–1985
5	05: 167: Весенние мероприятия	1969–1985
5	05: 168: Звездный луг: овцеводство	1972
5	05: 169: Государственные обои	1969–1985
5	05: 170: Стационарное производство	1969 Декабрь
5	05: 171: Изготовление соломенных цветов	1969 Сентябрь
5	05: 172: Трамвай: троллейбус убран на первом месте Запад	1972 7 сентября
5	05: 173: Фотографии самоубийц	1969 Май
5	05: 174: Лето: первый день	1969–1985
5	05: 175: Летние мероприятия	1971
5	05: 176: Начальная школа Саммита: Смитфилд	1969–1985
5	05: 177: Женская ассоциация Summit Park: четырехсторонняя Invitational, Smithfield, Veda Stiles и Helen Liechty.Первый ряд: Лола Райт, Бетти Пагмайр, Лана Ганнелл, Пенни Джонс, Сэнди Палмер и Джин Русе	1972 8 июня
5	05: 178: Спортивные товары Sunset	1970
5	05: 179: Спортивные товары Sunset: охотники на оленей	1969–1985
5	05: 180: Swagman Imports	1969–1985
5	05: 181: Купальники: фото чизкейка	1969–1985
5	05: 182: Несчастный случай при плавании	1969–1985
5	05: 183: Несчастный случай во время плавания: Утопление (почти) в Район Thrushwood на реке Логан	1972 25 мая
5	05: 184: Телефон: непристойные звонки	1969 Декабрь
5	05: 185: Победители Tetherball	(год?) 22 мая
5	05: 186: День благодарения: резьба по индейке	Ноябрь 1971 г.
5	05: 187: Пчела-молотилка	1970
5	05: 188: Турнир Tiddlywinks	1973
5	05: 189: ТОПС	1973 18 мая
5	05: 190: TOPS: тренажерный зал	1969–1985
5	05: 191: TOPS: тренажерный зал	1973 Январь
5	05: 192: Программа «Игрушки для малышей»: школа Уиттиер, Подготовка к Холли Фэйр, ВВС.Студенты ROTC настраивают Санта-Клауса мастерская по ремонту игрушек. (Слева направо) Дебби Стивенсон, Брюс Ричардс, Сьюзен Уайтселл, Энн Порселла (Альянс визуальных искусств), Энджел Флай и Арнольд Эйр Сообщество	(год?) 29 ноября
5	05: 193: Вандалы, связанные с тракторами: округ Франклин,	1973 6 мая
5	05: 194: Движение: между Логаном и Смитфилдом	1973 12 января
5	05: 195: Дорожный знак: вверх ногами, разворота нет. на 4-м севере 7-м востоке	1973 25 сентября
5	05: 196: Трейлер	(год?) 17 ноября
5	05: 197: Крушение поезда: 6-й Западный 2-й Северный	1973 20 сентября
5	05: 198: Крушение поезда	1972 12 августа
5	05: 199: Батутист	1972
5	05: 200: Дерево вниз: 5-й север	(год?) Сентябрь 30
5	05: 201: Дом на дереве: дом из веток	1969–1985
5	05: 202: Деревья: голубая ель перед Престоном Городские офисы	1972 24 октября
5	05: 203: Встреча Кооператива кормления Трентона.Сет Алдер, директор; Марион Олсен, режиссер, и Рид Робертс, спикер	1973
5	05: 204: Школа танца Тюллера	1972
5	05: 205: Tupperware	1971 Август
5	05: 206: Tupperware	1971
5	05: 207: Tupperware	1972 Август
5	05: 208: Tupperware	1973 Август
5	05: 209: Джамбори Tupperware	1969 Август
5	05: 210: Юбилей Tupperware	1972
5	05: 211: Близнецы: годовалые (Федерико).Чад Годфри-младший и Кристал Уиллис-старший, Джим Катрон читают лекцию	1969–1985
5	05: 212: Победитель UJHA Field Day: Стюарт Херефорд Ранчо	1971 июль
5	05: 213: United Fund	1969–1985
5	05: 214: United Fund	1969 Август
5	05: 215: United Fund	1972 17 октября
5	05: 216: У.С. Лесная служба	1969–1985
5	05: 217: Лесная служба США: фейерверки и тайник Национальный лес	(год?) Июль
5	05: 218: Почтовое отделение США	1969–1985
5	05: 219: У.S. Почтовая служба: P.O. сумка на молнии	1972 Февраль
5	05: 220: Дорожный патруль штата Юта	1969–1985
5	05: 221: Дорожный патруль Юты: офицер, всматривающийся в окно автомобиля	1977 Май
5	05: 222: Дорожный патруль Юты: полицейский участок, для Прогресс Дорога	1969–1985
5	05: 223: Дорожный патруль Юты: радар	1973 сентябрь
5	05: 224: Дорожный патруль Юты: класс самообороны	1972 Февраль
5	05: 225: Дорожный патруль Юты: полиция штата	1969–1985
5	05: 226: Дорожный патруль Юты: полиция штата	1969–1985
5	05: 227: Оружейная палаты Национальной гвардии штата Юта	1969–1985
5	05: 228: Коллегия адвокатов штата Юта	1969–1985
5	05: 229: Комиссия адвокатов штата Юта: Зал правосудия	(год?) 8 октября
5	05: 230: Коллегия адвокатов высшего образования штата Юта.	1969–1985
5	05: 231: Налоговая комиссия штата Юта (лицензия): Налоги Комиссионные	(год?) 15 февраля

Переосмыслите сложные тренировки, используя позитивный внутренний диалог ⋆ 4State News MO AR KS OK

Икс

data-ad-client = «ca-pub-1064213803427912» data-ad-slot = «4222299391»>

Продолжительный активный образ жизни требует самоотверженности, целеустремленности и немного психологической игры.Первые два достоинства знакомы каждому, кто пытался придерживаться программы упражнений, но третий пункт может не сразу прийти в голову.

Речь идет о применении основных техник позитивной психологии для поддержания мотивации.

Я впервые познакомился с концепцией позитивной психологии во время учебы в бакалавриате, но мне удалось пройти специальный курс по этой теме в Университете Канзаса во время моей докторской программы. Я сидел в комнате с другими докторантами, которые все учились на профессиональных психологов.

Я помню, как думал, что позитивная психология идеально вписывается в рамки моей области изменения поведения в отношении здоровья. И оказалось, что существует большое количество исследований, показывающих, как упражнения улучшают настроение. По мере улучшения настроения человек с большей вероятностью будет заниматься спортом, что улучшает настроение — и процесс становится самоподдерживающимся. Это крутой психологический цикл, который может изменить жизнь многих.

Одна из вещей, которые мы обсуждали на моем уроке позитивной психологии, — это самомотивация и методы, которые могут помочь людям изменить свое мышление в самый трудный момент.Есть несколько инструментов на выбор, но я остановлюсь только на нескольких моих любимых.

Во-первых, так важен позитивный внутренний диалог. Это именно то, на что это похоже. Будьте добры к себе, говоря себе: «Я того стою» и «Давай сделаем это», — это может быть мощной мотивацией. Многие люди начинают тренировки с противоположным мышлением. О, я был там. Некоторые дни труднее, чем другие, и я начал много тренировок с низкой мотивацией.

Ключ в том, чтобы управлять своим внутренним повествованием с помощью позитивных сообщений.Иногда негативные мысли приходят вам в голову, особенно во время самой сложной части тренировки. Такие мысли, как «Я не могу идти дальше» или «Я не приспособлен для этого», могут сократить тренировку. Когда происходит такой разговор с самим собой, может помочь метод, называемый «когнитивный рефрейминг».

Рефрейминг можно сравнить с взглядом на себя с точки зрения объектива камеры и переключением этих негативных мыслей на позитивные.

Когда негативные мысли приходят в голову во время тренировки, идея состоит в том, чтобы немедленно переключиться на точку обзора объектива камеры и признать свою собственную силу и стремление улучшить свое здоровье.Подумайте обо всех преимуществах вашей тренировки и о том, как станет лучше ваш день после тренировки.

Этот вид упражнений по рефреймингу в сочетании с позитивным внутренним диалогом является фантастическим способом улучшить приверженность к упражнениям в долгосрочной перспективе.

Упражнение на этой неделе дает прекрасную возможность для позитивного разговора с самим собой (и, возможно, переосмысления), потому что оно может быть сложной задачей. Гравитационный пресс на трицепс — это разновидность традиционных упражнений на трицепс с гантелями и подходит для всех уровней физической подготовки (но если у вас есть проблемы со спиной или плечом, сначала проконсультируйтесь со своим специалистом по здоровью).

[Видео не отображается выше? Нажмите здесь, чтобы посмотреть »arkansasonline.com/1025master/]

1. Возьмите пару гантелей среднего веса и лягте на спину на скамью.

2. Держа по гантели в каждой руке, согните оба локтя на 90 градусов.

3. Отсюда вытяните гантели назад горизонтально над головой, пока обе руки не будут вытянуты. Не позволяйте гантелям подниматься выше к потолку.

4. Когда обе руки вытянуты, переместите гантели назад над грудью.

5. Продолжайте горизонтальное движение гантелей 10 медленных повторений.

6. Выполните два подхода.

Это упражнение лучше всего выполнять очень медленно, чтобы в полной мере использовать силу тяжести, давя вниз с вытянутыми руками. Для его эффективности не требуется тяжелый вес, поэтому он мне нравится как для новичков, так и для экспертов.Однако при правильном выполнении это станет трудным — поэтому не забывайте использовать позитивный разговор с самим собой и, при необходимости, рефрейминг. Наслаждаться!

Мэтт Паррот рад слышать отзывы читателей. Отправьте ему вопросы или поделитесь историей о своих тренировках по пандемии по телефону

.

[email protected]

визуальных искусств | Brownell Talbot School

Учителя изобразительного искусства в Brownell Talbot создают уникальную учебную программу, которая позволяет каждому ученику реализовать свой художественный потенциал.На протяжении многих лет каждый студент может творить, используя рисунок, живопись, скульптуру, гравюру и керамику. Начиная с дошкольного образования, учащиеся знакомятся с изобразительным искусством через посещение их классом местными художниками из сообщества.

Философия

Программа изобразительного искусства направлена ​​на то, чтобы помочь студентам повысить технические способности, а также подтолкнуть их к более критическому мышлению и творческому решению проблем. От детского сада до шестого класса мы изучаем все художественные направления в течение года.Студенты изучают искусство многих культур по всему миру, находя между ними сходство и исследуя, как оно вписывается в нашу жизнь. Они также изучают хронологию истории искусства и множество различных художественных движений и художников.

Курсовая работа

Все ученики седьмого и восьмого классов посещают уроки изобразительного искусства и сосредотачиваются на отдельных элементах искусства наряду с принципами успешного дизайна. В старших классах школы ученики начинают с изучения художественных фондов. На этих курсах особое внимание уделяется перцептивным навыкам рисования, теории цвета, трехмерному дизайну и критике через практику альбомов.Эти курсы — живопись, гончарное дело или скульптура. Курсы сосредоточены на навыках и проблемах, связанных с каждым типом СМИ. После успешного завершения Art Foundation у студентов есть возможность расширить свой набор навыков, снова изучая живопись, гончарные изделия или скульптуру. Эти курсы сосредоточены на навыках и проблемах, связанных с каждым типом СМИ. Получив опыт работы со СМИ на одном из этих курсов, студенты могут перейти к «Портфолио», продвинутому курсу, который позволяет студентам создать уникальный комплекс работ в среде, в которой они чувствуют себя наиболее сильными.Студенты также имеют возможность пройти «Портфолио» в качестве интенсивного курса AP Studio, отправив свои портфолио в мае для получения кредита колледжа. Каждый класс соответствует всему учебному году. Внеклассные занятия, самостоятельное обучение с поездкой за границу, участие в выставках / конкурсах и приглашенные докладчики завершают впечатления от визуального искусства в Brownell Talbot.

студентов BT участвуют в местных художественных выставках, в том числе в художественных шоу Холокоста и летних фестивалях искусств, а также демонстрируют свои работы на местных площадках.Программа визуального искусства поддерживает Bead for Life на выставке BT’s Multicultural Fair для координации с африканским отделением, преподающим искусство в младших классах школы.